俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2, 由甘肃农业大学草业学院植物病理研究室柴兆祥教授惠赠。

1.2.1 碳、氮源对俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2营养生长与产孢量的影响 将俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2在PSA平板上25 ℃下培养3 d, 用灭菌的内径6 mm的打孔器切取菌落边缘菌饼, 分别转移至以蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇制成的7种不同碳源的固体培养基中央^{[15, 16, 17, 18, 19, 20, 21]}和以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、DL-天门冬酰胺、硝酸钾、尿素、硫酸铵制成的7种不同氮源的固体培养基中央^[22], 25 ℃黑暗培养3 d。3 d后用十字交叉法测量菌落生长直径, 6 d后用血球计数板镜检孢子数量^[23], 每处理 3 次重复。

1.2.2 温度对俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2营养生长与产孢量的影响 以直径6 mm的打孔器打取该菌株菌饼移至 PDA 培养基平板上, 分别置于 5、10、15、20、25、30和35 ℃共7个温度梯度下进行黑暗培养, 3 d后测量菌落生长直径, 6 d后镜检孢子数量, 每处理 3 次重复。

1.2.3 pH 值对俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2营养生长与产孢量的影响 利用0.1 mol· L^-1的HCl和0.1 mol· L^-1的NaOH将已灭菌的PDA培养基pH值分别调至为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0共10个梯度, 依次制成不同pH值的PDA平板。移植直径6 mm的俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2菌饼于PDA平板中央, 25 ℃下黑暗培养, 3 d后测量菌落生长直径, 6 d后镜检孢子数量, 每处理3次重复。

1.2.4 光照对俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2营养生长与产孢量的影响 在智能人工气候箱(宁波海曙赛福实验仪器厂, PRX-450C)内设置12 h光暗交替(12 h光+12 h黑暗)、24 h连续光照(气候箱灯管为40 W日光灯)、24 h连续黑暗(无光照条件)共3种光照条件。25 ℃下培养, 3 d后测量菌落生长直径, 6 d后镜检孢子数量, 每处理3次重复。

1.2.5 俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2孢子的致死温度测定 第1步, 将2 mL孢子悬浮液分别置于40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃恒温水浴锅中处理10 min, 吸取20 μ L孢子悬浮液制成玻片, 置于25 ℃保湿黑暗培养, 每处理重复3次, 于12、24和72 h后镜检孢子萌发情况; 第2步, 根据第1步试验结果, 把2 mL悬浮液置于66、67、68、69 ℃恒温水浴锅中处理10 min, 同第1步观察孢子萌发情况^[24], 同时吸取0.1 mL孢子悬浮液涂于PDA平板培养基上, 置于25 ℃培养箱内黑暗培养, 每处理重复3次, 5 d后检查PDA平板上菌落生长情况。

采用Excel 2010进行数据处理, 并采用DPS 2005软件进行单因素方差分析, Duncan氏新复极差法进行处理间差异显著性检验。

俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2在供试的7种碳源和7种氮源培养基上均能生长。生长最适的碳源为甘露醇, 平均菌落直径为75.3 mm, 显著大于其它6种碳源(P< 0.05); 其它6种碳源上的菌落直径为48.3~66.3 mm, 以淀粉和蔗糖为碳源培养基的菌落直径较低, 显著低于其它碳源培养基, 以葡糖糖、麦芽糖、乳糖和果糖为碳源的菌落直径差异不大(图1)。以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、天门冬酰胺为氮源, 菌落生长差异并不显著(图2), 以尿素为氮源培养基的菌落直径最低, 为5.0, 显著低于其它氮源培养基。

图1

Fig.1

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	图1 供试碳源对菌丝营养生长的影响Fig.1 Effects of different carbon sources values on mycelium growth 注:不同小写字母表示处理间差异显著(P< 0.05)。下同。 Note: Different lower case letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same below.

图2

Fig.2

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	图2 供试氮源对菌丝营养生长的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources values on mycelium growth

GAU 1-X-2菌株适宜产孢的碳源为葡萄糖和麦芽糖, 1 mL孢子悬浮液平均产孢对数值为9.06~9.12, 其中最适碳源为葡萄糖; 其次为乳糖、果糖、蔗糖、甘露醇和可溶性淀粉的产孢量, 1 mL孢子悬浮液平均产孢对数值8.47~8.81, 葡萄糖和麦芽糖之间, 乳糖和果糖之间, 蔗糖、甘露醇和淀粉之间差异不显著(P> 0.05), 但它们之间产孢量差异显著(P< 0.05)(图3)。

图3

Fig.3

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	图3 碳源对产孢量的影响Fig.3 Effects of different carbon sources on sporulation quantity

该菌株在10~35 ℃温度范围内均能生长, 平均菌落直径为1.3~71.2 mm。但在不同温度条件下, 该菌株菌落扩展速度不同, 适宜温度为20~25 ℃, 菌落平均直径为66.3~71.2 mm, 其中最适宜温度为20 ℃, 菌落平均直径高达71.2 mm。温度低于5 ℃, 菌落停止营养生长, 高于30 ℃菌丝生长速率减慢, 至35 ℃平均菌落直径为1.3 mm(图4)。在15~30 ℃的温度范围内该菌株均能产孢, 平均产孢量对数值为8.24~9.20, 适合产孢温度范围为20~30 ℃, 平均产孢量对数值为9.13~9.20, 其中最适宜产孢温度为20、25和30 ℃, 3个处理下产孢量差异不显著(P> 0.05), 但均显著高于15 ℃处理(P< 0.05)(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 温度对菌丝营养生长及产孢量的影响Fig.4 Effects of temperature on mycelium growth and sporulation quantity

pH为3.0时, PDA平板不凝固; pH为4.0时, PDA平板凝固较差。俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2在pH为5.0~12.0范围内菌丝均可进行营养生长, 对酸碱适应范围较广, 以pH为6.0~7.0菌丝营养生长较快, 其中最适pH为7.0, 平均菌落直径为66.3 mm; pH低于或高于7.0时, 菌丝生长速度开始下降(图5)。pH为8.0时的产孢量对数值为9.29, 显著高于除9.0以外的其它pH值(P< 0.05); pH为12.0时, 产孢量最低, 平均产孢量对数值为8.27(图5)。

图5

Fig.5

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	图5 pH对菌丝营养生长及产孢量的影响Fig.5 Effects of pH on mycelium growth and sporulation quantity

俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2对光照条件要求不太严格, 在24 h黑暗、24 h光照、12 h黑暗+12 h光照条件下, 平均菌落直径分别为66.3、56.0和56.7 mm, 24 h光照和12 h黑暗+12 h光照处理间异不显著(P> 0.05), 但二者均菌落直径均显著小于24 h黑暗条件下的菌落直径(P< 0.05)(图6)。产孢量以24 h黑暗处理最高, 显著高于其它两个处理; 24 h光照最低, 显著低于其它两个处理(图6)。

图6

Fig.6

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	图6 光照对菌丝营养生长及产孢量的影响Fig.6 Effects of light on mycelium growth and sporulation quantity

第1步试验结果显示, 俄罗斯木霉菌株GAU 1-X-2的孢子在40~65 ℃条件下处理10 min后仍能萌发, 而在70~80 ℃下不能萌发, 说明该菌株孢子的致死温度在66~69 ℃。第2步试验结果表明, 在66和67 ℃条件下, 孢子均能萌发, 5 d后能观察到有菌落生长, 菌落直径较小; 在68和69 ℃下未观察到有孢子萌发, 也未形成菌落, 说明该菌株孢子的致死温度是68 ℃, 10 min。