狗牙根内生固氮菌生长条件

引用本文

刘天增, 毛中伟, 张巨明. 狗牙根内生固氮菌生长条件. 草业科学, 2016,33(5):835-842
Liu Tian-zeng, Mao Zhong-wei, Zhang Ju-ming. Growth conditions of endophytic diazotroph isolated from Cynodon dactylon . Pratacultural Science,2016,33(5): 835-842 复制到剪切板

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《草业科学》编辑部

狗牙根内生固氮菌生长条件

刘天增, 毛中伟, 张巨明

华南农业大学林学与风景园林学院,广东省草业工程技术研究中心,广东广州 510642

张巨明(1963-),男,甘肃景泰人,副研究员,博士,主要从事草坪与草地生态研究。E-mail:[email protected]

第一作者:刘天增(1984-),男,甘肃永昌人,讲师,博士,主要从事草地病理学研究。E-mail:[email protected]

收稿日期: 2016-03-14

基金: 广东省自然科学基金(2015A030310200); 广东省科技计划项目(2012B020302002)

摘要

从已分离的多个狗牙根( Cynodon dactylon)内生固氮菌株中筛选到两株固氮酶活性较高的菌株7D和BM13,为明确固氮菌株对环境因子的适应性,研究了在不同的生长环境条件下菌株的生长量。采用Ashby无氮培养基,测定了温度、pH、渗透压以及不同氮源和碳源等环境条件对固氮菌生长的影响。结果表明,在10~40 ℃的温度范围内、pH值3.92~9.64的酸碱环境和30 g·L^-1 NaCl的高渗透压下,固氮菌7D和BM13均能正常生长;菌株能耐受0~10 mmol·L^-1的N₄⁺和 NO₃^-,而且能利用蔗糖、甘油、麦芽糖、甘露醇和葡萄糖等多种碳源生长。说明狗牙根内生固氮菌株7D和BM13对环境因子有很强的抗逆性和适应性,但两菌株之间存在一定差异,可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产菌种。

关键词: 内生固氮菌; 生长条件; 生物固氮

中图分类号:S543⁺.9 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)5-0835-08 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0706

Growth conditions of endophytic diazotroph isolated from Cynodon dactylon

Liu Tian-zeng, Mao Zhong-wei, Zhang Ju-ming

College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University,Guangdong Engineering Research Center of Grassland Science, Guangzhou 510642, China

Corresponding author: Zhang Ju-ming E-mail:[email protected]

Abstract

Effects of environmental factors on the growth of endophytic diazotroph strains 7D and BM13 isolated from Cynodon dactylon were investigated in our experiment. In this study, strains 7D and BM13 were examined for their adaptability to the stress of temperature, pH, NaCl, N₄⁺, NO₃^- and carbon sources by Ashby media. The results showed that the two strains could grow under wide range of temperature of 10~40 ℃ and pH from 3.92~9.64. The strains could also tolerate NaCl concentrations of 30 g·L^-1, N₄⁺,and NO₃^- concentrations of 0~10 mmol·L^-1, respectively. The strains were capable of using various carbon sources. It was suggested that the strains 7D and BM13 had superior tolerance to stress of diverse environment factors, but their tolerance abilities differed partly. Endophytic diazotroph strain is a candidate to be further developed for microbial fertilizer production.

Keyword: endophytic diazotroph; growth condition; biological nitrogen fixation

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氮是草坪生长发育过程中不可缺少的营养元素, 氮肥能加深草坪的颜色、增加密度、延长绿期、提高抗逆性等, 所以施用氮肥是获得高质量草坪的重要保证^[1]。目前, 在草坪养护管理中主要通过施用化学肥料来解决草坪氮素需求的问题。同时, 化肥的不合理施用造成氮素吸收利用率低、地下水污染、土壤板结等环境问题^[2]。因此, 急需寻找和发掘新的氮素资源, 部分替代或减少对工业氮肥的依赖, 可以有效解决以上问题。

植物内生固氮菌是近年来发现的存在于植物中的高效固氮体系, 可为许多非豆科植物固氮, 是环境友好、节能环保的氮素供应者, 在农业生产和科学研究中有重要意义。内生固氮菌在宿主植物中传导、定殖, 整个生活周期寄居在植物组织中生存、繁衍, 却不会对寄主植物造成伤害^[3]。从1986年开始, 研究人员相继从禾本科作物的根、茎、叶中分离筛选出多种内生固氮菌, 详细研究了它们的固氮特性, 结果证明内生固氮菌表现出很高的固氮效率^[4]。据报道, 内生固氮菌能提供寄主植物生长所需的氮素, 还可以分泌生长素, 促进植物生长, 增加生物量, 提高植物体内氮素含量和促进根系发育, 增强植株抗逆性^[5]。随着对植物内生固氮菌研究的逐步深入和不断发现的新菌种, 生物固氮表现出了巨大潜力和良好的应用前景^{[6, 7]}。

大量研究^{[8, 9]}表明, 植物接种固氮菌后一般都有增加氮素营养、促进生长和增产的效果, 尽管内生固氮菌有巨大的生物固氮潜力, 但其固氮效率却受到各种环境因子的影响, 导致固氮量不能持续增加, 植物增产效果不稳定。一般认为, 湿度、温度和盐度等环境因子的变化可能会直接或间接影响固氮菌的生长和固氮速率^{[10, 11]}。对于草坪生态系统来说, 日常的养护管理措施, 如施肥、喷农药等均会影响生物固氮效果。比如, 长期大量施用氮肥增加土壤中的有效氮含量, 会抑制固氮菌中固氮酶的活性和竞争优势^[12]。此外, 过量施肥会破坏生态系统养分平衡, 使固氮菌的生长和繁殖受到其它养分如磷、铁的限制, 进而影响生物固氮的过程, 降低固氮量^[13]。因此, 环境条件影响固氮菌的固氮效率, 导致接种效果不稳定, 在很大程度上制约了固氮菌在农业生产中的应用及商品化进程。

本研究以狗牙根植株中分离筛选获得的两株内生固氮菌为材料, 通过其对不同温度、酸碱度、渗透压、氮源和碳源等环境因子的适应性, 分析影响内生固氮菌生长和固氮酶活性表达的环境因子, 为进一步研究适宜狗牙根草坪的微生物接种剂或菌肥奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

内生固氮菌株7D和BM13由华南农业大学草坪实验室从校园内生长良好的狗牙根植株内分离得到。菌株7D菌落形态特征:白色透明, 圆形, 边缘整齐, 短杆状, 革兰氏阳性菌。菌株BM13菌落形态特征:黄色, 菌落较小, 圆形, 光滑, 杆状, 革兰氏阳性菌。经测定菌株7D和BM13的固氮酶活性分别为148.77和153.42 μ mol· (h· mL)^-1。经过16S rDNA和形态学鉴定, 菌株7D和BM13分别为Rhizobium meliloti和Pseudomonas rhodesiae^[14]。

1.2 培养基

固氮菌株生长培养基均采用Ashby无氮培养基:KH₂PO₄ 0.2 g· L^-1, CaCO₃ 5 g· L^-1, MgSO₄· 7H₂O 0.2 g· L^-1, 甘露醇10 g· L^-1, NaCl 0.2 g· L^-1, 琼脂18 g· L^-1, CaSO₄· 2H₂O 0.1 g· L^-1; pH 7.0。

1.3 试验方法

本试验以Ashby培养基为基础培养基, 研究温度、pH、渗透压、氮源和碳源等环境条件对固氮菌生长的影响^[15]。

1.3.1 温度对固氮菌生长的影响设置10、15、20、25、30、35、40 ℃共7个培养温度, 将固氮菌株7D和BM13按培养基体积2%的接种量接种于Ashby液体培养基中, 每组3次重复, 在不同培养温度的摇床中, 150 r· min^-1, 振荡培养36 h, UV-1201型分光光度计在600 nm波长处测定菌悬液的光密度值, 作为菌株生长量指标。

1.3.2 pH对固氮菌生长的影响以液体Ashby培养基为基本培养基, 将其pH设为4、5、6、7、8、9、10共7个梯度。高压蒸汽灭菌后, 重新测定灭菌后的7个梯度的pH值。将固氮菌株7D和BM13按培养基体积2%的接种量分别接种于上述培养液中, 每个处理3次重复, 30 ℃, 150 r· min^-1, 振荡培养36 h, UV-1201型分光光度计在600 nm波长处测定菌悬液的光密度值, 作为菌株生长量指标。

1.3.3 渗透压对固氮菌生长的影响以液体Ashby培养基为基本培养基, 在不添加NaCl的培养基中加入NaCl, 使NaCl的终浓度分别为0.2、10、20、30、40、50、60 g· L^-1共7个梯度。高压蒸汽灭菌后, 将固氮菌株7D和BM13按培养基体积2%的接种量分别接种于上述培养液中, 每个梯度3个重复, 30 ℃, 150 r· min^-1, 振荡培养36 h, UV-1201型分光光度计在600 nm波长处测定菌悬液的光密度值, 作为菌株生长量指标。

1.3.4 不同氮源对固氮菌生长的影响以液体Ashby培养基为基本培养基, 分别向培养基中加入KNO₃和NH₄Cl, 使N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 和N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 的浓度分别为0、1、2、3、4、5、6 mmol· L^-1共7个梯度。高压蒸汽灭菌后, 将固氮菌株7D和BM13按培养基体积2%的接种量分别接种于上述培养液中, 每个梯度3次重复, 30 ℃, 150 r· min^-1, 振荡培养36 h, UV-1201型分光光度计在600 nm波长处测定菌悬液的光密度值, 作为菌株生长量指标。

1.3.5 不同碳源对固氮菌生长的影响以液体Ashby培养基为基本培养基, 分别用等重量的蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、甘油、麦芽糖替代原培养基中的甘露醇, 配制7种含不同碳源的培养液。高压蒸汽灭菌后, 将固氮菌株7D和BM13按培养基体积2%的接种量分别接种于上述液体培养基中, 每组3个重复, 30 ℃, 150 r· min^-1, 振荡培养36 h, UV-1201型分光光度计在600 nm波长处测定菌悬液的光密度值, 作为菌株生长量指标。

1.4 统计分析

利用SPSS 16.0软件对不同生长条件下的固氮菌生长量进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 温度对固氮菌生长的影响

将供试菌株放在不同温度下培养。结果表明, 菌株7D和BM13在10~40 ℃范围内均能生长, 说明这两株固氮菌对温度的适应范围较广(图1)。随着培养温度升高, 两种菌株的生长量呈先增后减的趋势, 而且二者的最适生长温度有差异。菌株7D的较适生长温度为20~25 ℃, 与其它温度间的生长量均有显著差异 (P< 0.05)。菌株BM13的最适生长温度为20 ℃, 菌株生长量显著高于其它温度下的生长量。当培养温度大于各自的最适生长温度时, 菌株生长量逐渐下降。可见, 菌株7D和BM13都适合在较低温度下生长。

2.2 pH对固氮菌生长的影响

本研究以Ashby液体培养基作为菌株生长培养基, 由于Ashby培养基中含有CaCO₃, 而CaCO₃在灭菌的高温条件下发生分解, 会改变液体培养基的pH。所以, 应测定灭菌前后培养基的pH, 并以, 灭菌后的pH为准。灭菌前, 7个梯度的pH分别为4.00、5.04、6.01、7.02、8.03、9.03和10.00; 灭菌后, 相应的pH分别为3.92、5.08、5.85、6.93、7.90、8.88和9.64, 并以灭菌后的pH为准。

待测菌株的生长量随pH的变化趋势如图2所示。菌株在培养液pH为3.92~9.64的范围内都能生长, 说明两株固氮菌的酸碱适应范围较广。其中, 菌株7D在pH为5.85~6.93的范围内生长量急剧升高, 且在pH为6.93时生长量达到最大值, 显著高于其它pH处理(P< 0.05)。随后, 随着pH不断增加, 生长量又很快减小, 说明其最适合在pH为6.93接近中性的环境下生长。菌株BM13在pH为7.90时生长量最大, 说明其适合在碱性环境下生长。菌株BM13在pH分别为6.93、8.88和9.64时, 三者间生长量差异不显著(P> 0.05)。

2.3 渗透压对固氮菌生长的影响

不同种类的微生物对渗透压变化的适应能力不相同, 本研究用NaCl来调节培养基的渗透压。不同NaCl浓度的培养基对固氮菌生长量的影响明显不同(图3)。菌株7D在NaCl浓度为10~60 g· L^-1时生长量并没有发生明显的变化且相互之间差异不显著(P> 0.05), 说明菌株7D具有较高的耐盐能力且耐高盐的范围较大。而菌株BM13在NaCl浓度为0.2~30 g· L^-1的范围内, 随着NaCl浓度的增加生长量增大, 并在NaCl浓度为30 g· L^-1生长量达到最大值, 但与NaCl浓度为40和50 g· L^-1的生长量之间无显著差异。当NaCl浓度增加至60 g· L^-1时, 生长量急剧减小, 说明菌株BM13不耐高盐。

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图1 培养温度对固氮菌7D和BM13生长的影响
注:同一菌株不同小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.1 Effects of culture temperature on the growth of the endophytic diazotroph strain 7D and BM13
Note:Different lower case letters for the same endophytic diazotroph strain indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

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	图2 pH对固氮菌7D和BM13生长的影响Fig.2 Effects of culture media pH on the growth of the endophytic diazotroph strain 7D and BM13

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	图3 渗透压对固氮菌7D和BM13生长的影响Fig.3 Effects of NaCl concentration on the growth of the endophytic diazotroph strain 7D and BM13

2.4 不同氮源对固氮菌生长的影响

N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 和N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 可以为固氮菌的生长提供氮源。当N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 浓度为1 mmol· L^-1时, 菌株7D生长量最小, 固氮菌的生长受到抑制(图4)。随着N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 浓度的增加, 固氮菌的生长量也逐渐增加, 在N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 浓度为6 mmol· L^-1时, 菌株7D的生长量达到最大, 与其它浓度间差异显著(P< 0.05)。而菌株BM13随着N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 浓度的增加, 生长量也不断增加, 当N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 浓度为10 mmol· L^-1时, 生长量最大, 但与8 mmol· L^-1处理间差异不显著(P> 0.05), 表明N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 能促进菌株BM13的生长。

随着N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度的增加, 两种菌株生长量呈先增后减的趋势(图5)。菌株7D最适N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度为4 mmol· L^-1, N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度在4~10 mmol· L^-1范围内, 菌株生长量无显著变化(P> 0.05)。而BM13最适N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度为2 mmol· L^-1, 当N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度超过2 mmol· L^-1时, 菌株生长量随着N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度增加而出现轻微下降, 但无显著差异(P> 0.05)。说明高浓度N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 可能会不同程度地抑制固氮菌的生长。

总体而言, N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 在促进菌株7D和BM13的生长方面比N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 更明显, 但是氮源的浓度与菌株固氮酶活性之间的关系还有待研究。

2.5 不同碳源对固氮菌生长的影响

碳源是微生物生长不可缺少的物质, 碳源能为固氮菌进行固氮作用提供能量来源, 但固氮菌利用碳源的能力有所差异。菌株7D和BM13在柠檬酸和苹果酸为唯一碳源的培养基上基本不生长(图6), 说明这两株固氮菌利用柠檬酸和苹果酸的能力很低。除柠檬酸和苹果酸外, 菌株7D可利用其它几种碳源, 且不同碳源间无显著差异(P> 0.05)。菌株BM13在蔗糖、甘油和麦芽糖为碳源的培养基上生长良好, 生长量显著高于以甘露醇和葡萄糖为碳源的培养基(P< 0.05), 且菌株BM13利用蔗糖、甘油和麦芽糖的能力大于菌株7D。而菌株7D则能更好地利用甘露醇和葡萄糖。在这7种碳源中菌株BM13在甘油中生长量最大, 而菌株7D在麦芽糖中生长最好。

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	图4 不同N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 浓度对固氮菌7D和BM13生长影Fig.4 Effects of N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ concentration on the growth of the endophytic diazotroph strain 7D and BM13

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	图5 不同N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 浓度对固氮菌7D和BM13生长的影响Fig.5 Effects of N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ concentration on the growth of the endophytic diazotroph strain 7D and BM13

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	图6 不同碳源对固氮菌7D和BM13生长的影响Fig.6 Effects of carbon sources on the growth of the endophytic diazotroph strain 7D and BM13

3 讨论与结论

植物内生固氮菌的应用和发挥固氮作用除了受寄主植物品种、菌系影响外, 还与生态环境条件有密切关系^[16]。温度是影响固氮菌生长和存活最重要的因素。根据以往的研究报道, 一般固氮菌菌株的生长适宜温度范围在20~30 ℃^[17]。本研究显示, 固氮菌7D和BM13在25 ℃左右的温度下生长量最大, 与前人的研究结果一致^[18]。当温度低于15 ℃时, 固氮菌生长、繁殖缓慢, 酶活性较低。当培养温度高于15 ℃时, 固氮菌酶活性逐渐升高, 能利用培养基中更多的营养物质, 加快繁殖速率, 生长量大幅增加。但温度超过35 ℃时, 固氮酶活性受到抑制, 酶促反应变慢, 可利用的营养物质减少, 部分固氮菌可能死亡, 生长量逐渐降低。

pH过高或过低都不利于固氮菌的生长, 从pH影响研究结果来看, 两株内生固氮菌对酸碱度的适应范围较广, 在试验设定的pH范围内均能生长。pH为中性或略微偏碱的条件下生长最好。这说明固氮菌能通过自身代谢分泌物对周围环境酸碱度进行调节, 进而找到适宜生长的pH范围^[19]。7D在中性条件下生长量达到最大, BM13在碱性条件下生长良好, 说明BM13比7D更能适应盐碱性的土壤, 这为菌肥的开发提供了有利条件。

NaCl在维持细胞渗透压方面起着重要作用。一般认为, NaCl通过调节细胞膜结构的稳定性来平衡细胞内外的渗透压^[20]。渗透压影响固氮菌生长的机理较复杂, 目前国内对其研究较少。研究结果表明, 两株固氮菌都耐较高的渗透压。据报道, 在高NaCl浓度下, 菌株细胞会发生质壁分离, 细胞脱水死亡, 活菌数下降^[21]。7D比BM13具有更高的耐盐能力和更宽的耐高盐的范围。

固氮菌主要吸收N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 和N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 两种形态氮素, 固氮菌对不同氮源的吸收利用有所差异。从本研究结果来看, 低浓度的N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 和N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 会促进固氮菌的生长, 高浓度的N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 和N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 会抑制固氮菌的生长, 而且N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 下培养的固氮菌生长量高于N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 下培养。此结果与Andre等^[22]的报道一致, 即内生固氮菌随着培养基中氮元素含量的增加, 其生长被抑制得越来越严重。同时有研究也表明N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+} \end{matrix}$ 和N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 均不同程度地抑制固氮酶活性, 但N $\begin{matrix} {O_{3}}^{-} \end{matrix}$ 对固氮菌的抑制作用明显高于N $\begin{matrix} {H_{4}}^{+}^{[23 - 24]} \end{matrix}$ 。

碳源能提供固氮菌生长所需要的能量, 也是构成固氮菌细胞碳架的物质之一。本研究中, 两株固氮菌在以蔗糖和葡萄糖、甘露醇、甘油、麦芽糖为碳源的培养基上生长较好, 而在柠檬酸和苹果酸为碳源的培养基上均不能生长, 说明菌株在生长过程中有机酸不是最主要的碳源。对羊草(Leymus chinensis)和小麦(Triticum aestivum)根际固氮菌的研究中发现, 最佳碳源为蔗糖, 而在柠檬酸培养基上同样不能正常生长^{[25, 26]}。陈倩等^[27]对固氮菌Paenibacillus的研究表明, 在甘油和蔗糖为唯一碳源的培养基上生长良好, 在以柠檬酸和苹果酸为唯一碳源的培养基上基本不生长。从成本来看, 蔗糖的价格较低, 容易获取, 因此, 蔗糖是固氮菌体系最好的碳源。

本研究从狗牙根中分离的内生固氮菌对温度的适应范围较广, 对高温的忍耐能力高于对低温的忍耐能力, 这表明菌株的固氮活性可能与菌株生长的热带环境以及菌株分离的季节相关。本研究所用菌株是在广州春季草坪刚返青时分离得到的, 所以菌株的最适生长温度在20 ℃左右。此外, 固氮菌株酸碱适应范围宽, 有一定的耐盐耐高氮能力, 表现出对环境因子的良好适应性。对狗牙根内生固氮菌株的最适生长条件进行测定和分析, 可以为后续确定最佳发酵条件和生态适应性评价以及在热带、亚热带地区地生产利用提供理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[17]	满百膺, 陈秀蓉, 李振东. 高寒牧草内生细菌分离培养条件的优化. 草原与草坪, 2008(5): 27-30. Man B Y, Chen X R, Li Z D. Optimization for isolation and culture conditions of endophytic bacteria in grasses in alpine area. Grassland and Turf, 2008(5): 27-30. (in Chinese) [本文引用:1]
[18]	朱茂山, 关天舒. 发酵条件对生防细菌B301生长及抑菌物质产生的影响. 吉林农业大学学报, 2008, 30(3): 23-267. Zhu M S, Guan T S. Effect of fermentation conditions on germ formation and production of antibiotics of Strain B301. Journal of Jilin Agricultural University, 2008, 30(3): 23-267. (in Chinese) [本文引用:1]
[19]	申磊, 曾凤云, 谭志远. pH、温度、N₄⁺和盐度对圆果雀稗内生固氮菌固氮特性的影响. 热带亚热带植物学报, 2007, 15(1): 40-44. Shen L, Zeng F Y, Tan Z Y. Effects of pH, temperature, N₄⁺ and salinity on acetylene reduction (nitrogen fixation) in endophytic diazotrophs from Paspalum orbiculare. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2007, 15(1): 40-44. (in Chinese) [本文引用:1]
[20]	米琴, 张玉琴, 陈义光, 鲍敏, 陈志. 青海盐环境下革兰氏阳性中度嗜盐细菌的分离及其生物学特性. 陕西师范大学学报, 2005, 33(3): 86-90. Mi Q, Zhang Y Q, Chen Y G, Bao M, Chen Z. Biological characteristics and isolation of Gram-positive moderately halophilic bacteria under saline environments in Qinghai. Journal of Shaanxi Normal University, 2005, 33(3): 86-90. (in Chinese) [本文引用:1]
[21]	Miller K J. Effects of temperature and sodium chloride concentrations on the phospholipid and fatty acid composition of a halotolerant Planococcus sp. Journal of Bacieriology, 1985, 162: 263-270. [本文引用:1]
[22]	Andre L, Erineudo L, Segundo U. Yield of micropropagated sugareane varieties in different soil types following inoculation with diazotrophic baeterias. Plant and Soil, 2006, 284(2): 23-32. [本文引用:1]
[23]	严君, 韩晓增, 王守宇, 王树起, 李晓慧. 不同形态氮对大豆根瘤生长及固氮的影响. 大豆科学, 2009, 28(4): 674-677. Yan J, Han X Z, Wang S Y, Wang S Q, Li X H. Effect of different forms nitrogen on nodule growth and nitrogen fixation in soybean. Soybean Science, 2009, 28(4): 674-677. (in Chinese) [本文引用:1]
[24]	宋海星, 申斯乐, 马淑英, 阎石, 刘金萍, 赵玉敏. 硝态氮和氨态氮对大豆根瘤固氮的影响. 大豆科学, 1997, 16(4): 283-286. Song H X, Shen S L, Ma S Y, Yan S, Liu J P, Zhao Y M. Effect of N-N on the nitrogen fixation of soybean nodules. Soybean Science, 1997, 16(4): 283-286. (in Chinese) [本文引用:1]
[25]	关秀清, 杜千有. 内蒙古羊草根际联合固氮菌的分离鉴定及其生理生化特性的研究. 草地学报, 1997, 5(2): 101-107. Guan X Q, Du Q Y. Isolation and characteristics of N₂-fixers from rhizosphere of plant Leymus chinensis in the rangeland of Inner Mongolia. Acta Agresia Sinica, 1997, 5(2): 101-107. (in Chinese) [本文引用:1]
[26]	姚拓, 龙瑞军, 王刚, 胡自治. 兰州地区盐碱地小麦根际联合固氮菌分离及部分特征研究. 土壤学报, 2004, 41(3): 444-448. Yao T, Long R J, Wang G, Hu Z Z. Isolation and characteristics of associative symbiotic nitrogen bacteria from rhizosphere of wheat in saline soil in Lanzhou area. Acta Pedologica Sinica, 2004, 41(3): 444-448. (in Chinese) [本文引用:1]
[27]	陈倩, 高淼, 胡海燕, 徐晶, 周义清, 孙建光. 一株拮抗病原真菌的固氮菌Paenibacillus sp. GD812. 中国农业科学, 2011, 44(16): 3343-3350. Chen Q, Gao M, Hu H Y, Xu J, Zhou Y Q, Sun J G. A nitrogen-fixing bacterium Paenibacillus sp. GD812 antagonistic against plant pathogenic fungi. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(16): 3343-3350. (in Chinese) [本文引用:1]

2008

0.0

... 氮是草坪生长发育过程中不可缺少的营养元素,氮肥能加深草坪的颜色、增加密度、延长绿期、提高抗逆性等,所以施用氮肥是获得高质量草坪的重要保证^[1] ...

2008

0.0

... 同时,化肥的不合理施用造成氮素吸收利用率低、地下水污染、土壤板结等环境问题^[2] ...

1992

0.0

... 内生固氮菌在宿主植物中传导、定殖,整个生活周期寄居在植物组织中生存、繁衍,却不会对寄主植物造成伤害^[3] ...

1986

0.0

... 从1986年开始,研究人员相继从禾本科作物的根、茎、叶中分离筛选出多种内生固氮菌,详细研究了它们的固氮特性,结果证明内生固氮菌表现出很高的固氮效率^[4] ...

2009

0.0

... 据报道,内生固氮菌能提供寄主植物生长所需的氮素,还可以分泌生长素,促进植物生长,增加生物量,提高植物体内氮素含量和促进根系发育,增强植株抗逆性^[5] ...

2003

0.0

... 随着对植物内生固氮菌研究的逐步深入和不断发现的新菌种,生物固氮表现出了巨大潜力和良好的应用前景^[6,7] ...

2005

0.0

... 随着对植物内生固氮菌研究的逐步深入和不断发现的新菌种,生物固氮表现出了巨大潜力和良好的应用前景^[6,7] ...

2004

0.0

房增国, 左元梅, 李隆, 张福锁. 玉米-花生混作体系中不同施氮水平对花生铁营养及固氮的影响. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(4): 386-390.

Fang Z

, Zuo Y

, Li

, Zhang F

Effects of different nitrogen levels on iron nutrition and nitrogen fixation of peanut in maize-peanut mixed cropping system.

Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2004, 10(4): 386-390. (in Chinese)

Maize-peanut mixed cropping could obviously improve iron nutrition of peanut under different nitrogen levels in pot experiment. Compared with sole cropping peanut, not only the chlorophyll SPAD value was (increased), but also active iron concentration was increased by 12.4%—27.1% in young leaves of mixed cropping peanut, at the same time the excisable nodule number and nodule nitrogenase activities (ARA) per plant peanut also were increased significantly. Both the nitrogen level and planting pattern had no great effect on peanut dry weight in this experiment. The more nitrogen fertilization could increase active iron concentration in the rhizophere of maize, but inhibit excisable nodule number and nitrogenase activities of peanut. The results showed that maize-peanut mixed cropping played an important role in improving iron nutrition and nitrogen fixation function of peanut on calcareous soil. The different nitrogen levels had no great effect on iron nutrition of peanut, but it restrained symbiotic nitrogen fixation of peanut with nitrogen application increase.

Dept. of Plant Nutrition, CAU, Key Lab. of Plant Nutrition, MOA, Key Lab. of Plant-Soil Interactions;MOE;Beijing 100094;China

盆栽试验结果表明,不同氮水平条件下玉米—花生混作可明显改善花生铁营养。与单作相比,混作花生新叶叶绿素SPAD值明显提高,新叶活性铁浓度提高12.4%～27.1%,同时花生根瘤数和固氮酶活性显著增加。在本试验种植密度下,施氮水平和种植方式对单株花生生物量无显著影响,而施氮对玉米根际土壤活性铁浓度的提高有一定的促进作用,并且花生根瘤数和固氮酶活性受施氮水平影响较大。说明石灰性土壤上玉米—花生混作对花生铁营养改善及提高花生的固氮能力具有重要作用;施氮水平对花生铁营养影响不大,但随施氮量增加对花生共生固氮有抑制作用。

... 大量研究^[8,9]表明,植物接种固氮菌后一般都有增加氮素营养、促进生长和增产的效果,尽管内生固氮菌有巨大的生物固氮潜力,但其固氮效率却受到各种环境因子的影响,导致固氮量不能持续增加,植物增产效果不稳定 ...

1999

0.0

2014

0.0

许沛冬, 赵艳, 张晓波, 李新英. 草地早熟禾根际固氮菌的培养. 草业科学, 2014, 31(6): 1033-1038.

Xu P

, Zhao

, Zhang X

, Li X

Culture condition of nitrogen fixation strains isolated from rhizosphere of Kentuckey bluegrass.

Pratacultutral Science, 2014, 31(6): 1033-1038. (in Chinese)

Culture conditions and typical growth curve of eight nitrogen-fixing bacteria strains with strong ability of nitrogenase activity and the solubilizing phosphorus capability isolated from Kentucky bluegrass rhizosphere soil samples were studied. The results showed that the temperature adaptation scope of strains was wide and strains could grow well between 20～40 ℃, with the optimum growth temperature of 25 ℃. The nitrogen fixation strains could grow well in a neutral or slightly alkaline pH condition, with the optimum initial pH range of 7.0 to 7.5. The optimum ventilation volume of strain N 4 , N 5 , N 10 , N 16 , N 17 and N 20 were 220 mL, and the optimum ventilation volume of strain N 2 and N 14 were 200 and 100 mL. Based on the above results, the typical nitrogen-fixing bacteria strains growth curves were determined. Most of the strains entered the logarithmic phase after 2 h. Different strains started the lag phase, the logarithmic phase, the stationary phase and the declining phase at different culture time.

1.Key Laboratory of Protectionand Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources (Hainan University), Ministry of Education, Haikou 570228, China; 2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 3.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Inner Mongolia Ulanqab, Jining 012000, China

从草地早熟禾( Poa pratensis )根际土壤中筛选得到8 株具有较高固氮、溶磷能力的高效固氮菌菌株，研究其培养条件及典型生长曲线。结果表明，本研究筛选得到的菌株对温度的适应范围比较广，在20～40 ℃的环境条件下可以正常完成新陈代谢及繁殖发育，最适生长温度为25 ℃;菌株在中性或偏碱性的条件下生长较好，最适生长初始pH值为7.0～7.5;菌株N 4 、N 5 、N 10 、N 16 、N 17 、N 20 的最佳通气量为220 mL，菌株N 2 、N 14 的最佳通气量分别为200及100 mL。根据所得数据，进一步试验，得到了固氮菌菌株的典型生长曲线，绝大部分的菌株在培养2 h后就进入了对数生长期，不同的菌株进入延时期、对数期、稳定期、衰亡期的时间及持续时间也不同。

... 一般认为,湿度、温度和盐度等环境因子的变化可能会直接或间接影响固氮菌的生长和固氮速率^[10,11] ...

2005

0.0

... 一般认为,湿度、温度和盐度等环境因子的变化可能会直接或间接影响固氮菌的生长和固氮速率^[10,11] ...

2007

0.0

... 比如,长期大量施用氮肥增加土壤中的有效氮含量,会抑制固氮菌中固氮酶的活性和竞争优势^[12] ...

2000

0.0

... 此外,过量施肥会破坏生态系统养分平衡,使固氮菌的生长和繁殖受到其它养分如磷、铁的限制,进而影响生物固氮的过程,降低固氮量^[13] ...

2014

0.0

刘天增, 毛中伟, 李凤娇, 张巨明. 狗牙根内生固氮菌的分离鉴定. 草业科学, 2014, 31(7): 1254-1260.

Liu T

, Mao Z

, Li F

, Zhang J

Isolation and identification of endophytic diazotroph from Cyndon dactylon.

Pratacultutral Science, 2014, 31(7): 1254-1260. (in Chinese)

The nitrogenase activities of endophytic diazotrophs in Cyndon dactylon were studied by acetylene reduction assay (ARA). The results showed that 24 endophytic diazotrophs had been obtained using N-free medium. Significant differences in nitrogenase activities were observed among the endophytic diazotrophs, ranging from 3.45 to 383.05 μmol·h -1 ·mL -1 . Nitrogenase from the strains of GC-1 had the highest activity. Nine strains with higher nitrogenase activity were identified as Klebsiella,Enterobacter,Pseudomonas,Pantoea and Rhizobium , respectively, by morphological, physiological-biochemical characterization and 16S rDNA sequence analysis.

College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

以野外不同地点采集的狗牙根( Cynodon dactylon )为材料,对其内生固氮菌进行分离和鉴定,并测定内生固氮菌的固氮酶活性。结果表明,从狗牙根中共分离得到了24株具有固氮酶活性的菌株,且菌株之间的固氮酶活性有较大差异。其中固氮酶活性最高的是材料GC分离的固氮菌GC-1(383.05 μmol·h -1 ·mL -1 ),最低的是材料BM-1分离的固氮菌BM-1-1(仅为3.45 μmol·h -1 ·mL -1 )。从分离出的固氮菌中筛选出9株固氮酶活性较高的菌株,鉴定结果表明其分别属于假单胞菌属、泛菌属、根瘤菌属、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌。本研究证明,可以从狗牙根中分离得到具有高固氮酶活性的菌株,对禾草生物固氮具有重要应用前景。

... 经过16S rDNA和形态学鉴定,菌株7D和BM13分别为Rhizobium meliloti和Pseudomonas rhodesiae^[14] ...

2009

0.0

... 3 试验方法本试验以Ashby培养基为基础培养基,研究温度、pH、渗透压、氮源和碳源等环境条件对固氮菌生长的影响^[15] ...

2013

0.0

... 3 讨论与结论植物内生固氮菌的应用和发挥固氮作用除了受寄主植物品种、菌系影响外,还与生态环境条件有密切关系^[16] ...

0.0

... 根据以往的研究报道,一般固氮菌菌株的生长适宜温度范围在20~30 ℃^[17] ...

2008

0.0

... 本研究显示,固氮菌7D和BM13在25 ℃左右的温度下生长量最大,与前人的研究结果一致^[18] ...

2007

0.0

... 这说明固氮菌能通过自身代谢分泌物对周围环境酸碱度进行调节,进而找到适宜生长的pH范围^[19] ...

2005

0.0

... 一般认为,NaCl通过调节细胞膜结构的稳定性来平衡细胞内外的渗透压^[20] ...

1985

0.0

... 据报道,在高NaCl浓度下,菌株细胞会发生质壁分离,细胞脱水死亡,活菌数下降^[21] ...

2006

0.0

... 此结果与Andre等^[22]的报道一致,即内生固氮菌随着培养基中氮元素含量的增加,其生长被抑制得越来越严重 ...

2009

0.0

1997

0.0

1997

0.0

关秀清, 杜千有. 内蒙古羊草根际联合固氮菌的分离鉴定及其生理生化特性的研究. 草地学报, 1997, 5(2): 101-107.

Guan X

, Du Q

Isolation and characteristics of N₂-fixers from rhizosphere of plant Leymus chinensis in the rangeland of Inner Mongolia.

Acta Agresia Sinica, 1997, 5(2): 101-107. (in Chinese)

Two strains with higher nitrogen-fixation activities among the six strains of N 2 fixers, have been isolated from the soil of Leymus chinensis rhizosphere in the grassland Inner mongolia.According to the characteristics of morphological character and physiobiochemistry of the strains, the strain A-1 belongs to the Klebsiella axytaca , the other one B-18 belongs to the Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae .The two strains have higher nitrogenase activity under the condition of low pressure of oxygen.

Instifute of Botony, Academia Sinica, Beijing 100093

作者从内蒙古锡林郭勒草原优质牧草-羊草( Leymuschinensis )根际分离筛选出两株根际联合固氮菌。根据形态特征和生理生化特性,菌株A－1属催娩克雷伯氏菌( Klebsiella oxytoca ),菌株B－18属肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种( Klebsiella pneumoniaesubsp. pneumoniae )。对其进行生理生化特性、培养特性、固氮酶活性、氧浓度对固氮酶活性影响等方面的研究。结果表明,菌株均在微好氧条件下固氮活性最高,在Hill无氮培养基上30℃恒温培养,其固氮酶活性分别在18和16小时左右达到最高峰。

... 对羊草(Leymus chinensis)和小麦(Triticum aestivum)根际固氮菌的研究中发现,最佳碳源为蔗糖,而在柠檬酸培养基上同样不能正常生长^[25,26] ...

2004

0.0

... 对羊草(Leymus chinensis)和小麦(Triticum aestivum)根际固氮菌的研究中发现,最佳碳源为蔗糖,而在柠檬酸培养基上同样不能正常生长^[25,26] ...

2011

0.0

陈倩, 高淼, 胡海燕, 徐晶, 周义清, 孙建光. 一株拮抗病原真菌的固氮菌Paenibacillus sp. GD812. 中国农业科学, 2011, 44(16): 3343-3350.

Chen

, Gao

, Hu H

, Xu

, Zhou Y

, Sun J

A nitrogen-fixing bacterium Paenibacillus sp. GD812 antagonistic against plant pathogenic fungi.

Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(16): 3343-3350. (in Chinese)

【Objective】 The objective of this study is to screen nitrogen-fixing bacteria antagonistic against plant pathogenic fungi and research nitrogenase activity, nifH, physiological and biochemical characteristics, identification, stress resistance of the functional strains and inoculation effect on plant and to prepare strains for microbial fertilizer production. 【Method】 Nitrogen-free medium was used to isolate nitrogen-fixers and confrontation method was used to screen antagonistic bacteria against plant pathogenic fungus. Nitrogenase activity was determined with acetylene reduction assay. 16S rDNA and nifH were amplified with PCR. Strain identification was carried out based on the morphology, physiology, and biochemical test and 16S rDNA sequence analysis. Microbial inoculation effect on plant was tested with a pot culture in green house. 【Result】 One strain designated as GD812 was selected, which showed nitrogenase activity 30.661 nmol C2H4/h•mg protein, and strongly antagonistic against plant pathogenic fungi Gibberella zeae and Verticillium dahliae with the inhibition rate of 59.5% and 49.3%, respectively. nifH of GD812 is 300 bp sharing 98% sequence identity with that of Paenibacillus sp. Bs57. GD812 was identified as Paenibacillus sp. based on the results of morphology, physiology and biochemical test and 16S rDNA sequence analysis. Further investigations showed that GD812 could use 20 of the 35 tested carbon sources, could grow under temperature ranging from 4 to 50℃, and could grow in range of pH4 to11. Pot culture result showed that fresh weight of Chinese cabbage inoculated with GD812 increased by 52% compared with the control. 【Conclusion】 The newly selected Paenibacillus sp. GD812 showed high nitrogenase activity, strong antagonism against plant pathogenic fungi, extensive carbon source utilization, stress resistance and good inoculation effect, which is a candidate to be further developed for microbial fertilizer production.

中国农业科学院农业资源与农业区划研究所／农业部作物营养与施肥重点实验室

【目的】筛选具有拮抗病原真菌功能的固氮菌，研究菌株的固氮酶活性、nifH、生理生化特征、菌株抗逆性与接种效果等，并对该菌株进行鉴定，为微生物肥料生产筛选菌种资源。【方法】采用无氮培养基富集、筛选固氮菌，用对峙法筛选拮抗菌；乙炔还原法测定固氮酶活性，PCR扩增16S rDNA和nifH；通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种；采用温室盆栽小白菜试验接种效果。【结果】筛选到1株固氮菌GD812，该菌株固氮酶活性达到30.661 nmol C2H4/h•mg蛋白，同时具有拮抗麦类赤霉病菌（Gibberella zeae）和棉花黄萎病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）功能，抑菌率分别达到59.5%和49.3%；根据形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，GD812被鉴定为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.；该菌株的nifH基因长度300 bp，与Paenibacillus sp. Bs57 nifH基因序列相似性98%；GD812可以利用35种供试碳源中的20种，耐酸碱pH4—11，在4—50℃均可生长，盆栽试验接种比对照小白菜鲜重增加52%。【结论】固氮菌GD812被鉴定为类芽孢杆菌，该菌株利用碳源广泛，抗逆性强，具有较高的固氮酶活性和拮抗病原真菌能力，盆栽试验显示较好的接种效果，可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产菌种。

... 陈倩等^[27]对固氮菌Paenibacillus的研究表明,在甘油和蔗糖为唯一碳源的培养基上生长良好,在以柠檬酸和苹果酸为唯一碳源的培养基上基本不生长 ...