本研究共选用常用白三叶品种15个(表1), 均于2012年从种子公司购买, 全部种植在北京市顺义区中国农科院试验基地。试验地地处40° 13' N, 116° 38' E, 海拔35 m, 年均降水量约625 mm。土壤为砂壤土, 有机质含量为1.35%, 全氮含量为0.9%, 速效磷含量26.16 mg· kg^-1, 速效钾含量42.35 mg· kg^-1, 属微碱性土壤, pH为8.3。播种3个月后对植株幼嫩叶片进行取样。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试白三叶品种名称及来源 Table 1 Names and origins of tested white clovers 编号 Code 品种名 Cultivar name 产地 Origin 来源 Source L1 百事 Pepsi 丹麦 Denmark 百绿国际草业(北京)有限公司 Barenbrug Grass Industry International (Beijing) Co., LTD L2 鄂牧一号 Emu No.1 中国 China 北京国人园艺有限公司 Beijing Guorenyuanyi Co., LTD L3 碧盛 Zapican 阿根廷 Argentina 北京克劳沃草业技术开发中心 Beijing Clover Grass Industry Technology Development Center L4 雷托 Retor 荷兰 Holland 北京克劳沃草业技术开发中心 Beijing Clover Grass Industry Technology Development Center L5 瑞文德 Rivendel 丹麦 Denmark 北京克劳沃草业技术开发中心 Beijing Clover Grass Industry Technology Development Center L6 瑞加 Regal 美国 USA 北京克劳沃草业技术开发中心 Beijing Clover Grass Industry Technology Development Center L7 拉迪诺 Ladino 美国 USA 百绿国际草业(北京)有限公司 Barenbrug Grass Industry International (Beijing) Co., LTD L8 海法 Haifa 澳大利亚 Australia 北京禾木青科技有限责任公司 Beijing Hope Turf Techenogy Co., LTD L9 荷兰白 Dutch 澳大利亚 Australia 北京禾木青科技有限责任公司 Beijing Hope Turf Techenogy Co., LTD L10 胡以阿 Huia 新西兰 New Zealand 北京冠绿草业科技发展中心 Beijing Guanlv Grass Industry Technology Development Center L11 考拉 Koala 澳大利亚 Australia 北京冠绿草业科技发展中心 Beijing Guanlv Grass Industry Technology Development Center L12 铺地 Prop 澳大利亚 Australia 北京冠绿草业科技发展中心 Beijing Guanlv Grass Industry Technology Development Center L13 克朗德 Klondike 丹麦 Denmark 北京国人园艺有限公司 Beijing Guorenyuanyi Co., LTD L14 米尔卡 Milkanova 丹麦 Denmark 北京国人园艺有限公司 Beijing Guorenyuanyi Co., LTD L15 路易斯安那 Louisiana 美国 USA 北京克劳沃草业技术开发中心 Beijing Clover Grass Industry Technology Development Center

表1 供试白三叶品种名称及来源 Table 1 Names and origins of tested white clovers

DNA提取利用全式金试剂盒(Transgen, China), 每个材料取15株幼嫩叶片混合取样。PCR所需引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司(AuGCT. Biotech Co., Ltd.)合成。

根据哥伦比亚大学公布的ISSR序列合成100条ISSR引物。ISSR体系为25 μ L, 其中DNA(40 ng· μ L^-1)1 μ L , 引物(5 mmol· L^-1)1 μ L, 10× buffer 2.5 μ L, MgCl₂(25 mmol· L^-1)2 μ L, Taq DNA polymerase (1 U)1 μ L, dNTP(10 mmol· L^-1)2 μ L和无核酸酶水15.5 μ L。PCR程序为 94 ℃ 5 min; 94 ℃变性30 s, 退火温度 55~59 ℃, 1 min, 72 ℃延伸90 s, 35个循环; 72 ℃延伸5 min。扩增后产物保存在4 ℃冰箱。

电泳检测:1.5%的琼脂糖凝胶, 指示剂为北京原平皓公司生产的gelsafe(10 000× )。采用北京六一厂DYY-7C型电泳仪和DYC-34A型电泳槽在90 V的电压下进行1 h电泳, 电泳液为TAE buffer, 100 bp的DNA Marker。利用伯乐公司凝胶成像系统进行紫外观测, 记录多态性条带。

利用通用引物T4(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)和T5(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行扩增。PCR反应体系为25 μ L, DNA(40 ng· μ L^-1)1 μ L, 上下游引物各(5 mmol· L^-1)1 μ L, 10× buffer 2.5 μ L, MgCl₂(25 mmol· L^-1)2 μ L, Taq DNA polymerase (1 U)1 μ L, dNTP (10 mmol· L^-1) 2 μ L和无核酸酶水14.5 μ L。PCR反应程序:94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 52 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 共35个循环; 最后72 ℃延伸10 min, 产物于4 ℃保存。PCR产物检测:PCR产物5 μ L用gelsafe染色, 125 V的电压下进行25 min电泳, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 用凝胶成像仪照相。

测序:PCR产物经纯化试剂盒(全式金试剂盒, Transgen, China)纯化后送由中国农业科学院重大工程楼进行正反向测序。

ISSR分析根据条带的有无分别标记为1或0。材料间遗传相似系数(GS)根据公式GS=2N_ij(N_i+N_j)计算, 其中:N_ij为材料N_i和N_j共有的扩增片段数目, N_i为材料i中出现的扩增片段数目, N_j为材料j中出现的扩增片段数目。将GS值按不加权成对群算术平均法(UPGMA)进行遗传相似性聚类。统计分析在NTSYS 2.1软件下进行。

将所有测得的序列登录到Genbank, 获取序列登录号。ITS分析用DNAStar分析各序列同源性, 用CLustalX 2.0完成DNA序列的完全对比, 保存为.aln格式, 然后运用系统发育软件MEGA 4.1软件转换成.meg格式, 系统树以苜蓿(Medicago sativa)(AF053142.1)为外群采用邻接距离矩阵法(neighbor-joining)构建, 应用自展法(bootstrap)进行可信度检测, 重复1 000次。

利用两个白三叶品种海法和胡以阿对100条ISSR引物进行筛选, 从中筛选出条带清晰、重复性高、表达稳定的5条ISSR引物, 即810、816、822、826和836(表2)。

利用所选的5条引物对15个白三叶品种进行PCR正式扩增, 共得到DNA条带41条, 扩增条带变幅为7~10条, 平均每个引物可以扩增出8.2条(表2)。在41条带中, 多态性条带为38条, 扩增多态性条带变幅为6~9条, 平均占比为92.68%, 平均每个引物可以扩增出多态性条带7.6条。这说明ISSR标记能够揭示出白三叶品种之间较高的多态性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 ISSR引物序列和特异性条带数目 Table 2 List of ISSR primers and polymorphic bands 引物编号 Primer No. 序列 Sequence 退火温度 Tm/℃ 扩增的DNA条带数 Amplification of DNA banding 多态性条带 Polymorphism bands 多态性条带比率 Polymorphism bands percentage/% 810 (GA)8A 44.3 10 9 90.00 816 (CA)8T 51.1 9 9 100.00 822 (TC)8A 45.8 7 6 85.71 826 (AC)8C 53.3 8 8 100.00 836 (AG)8CA 50.9 7 6 85.71 合计Total 41 38 平均Average 8.2 7.6 92.68

表2 ISSR引物序列和特异性条带数目 Table 2 List of ISSR primers and polymorphic bands

基于遗传相似系数, 对白三叶进行UPGMA聚类分析, 将15个白三叶品种聚为两大类(图1)。第Ⅰ 类中, 丹麦的百事和米尔卡亲缘关系较近, 且这两个品种均为中叶型白三叶; 与小叶型的瑞文德和大叶型的克朗德共同构成了第1亚类; 澳大利亚的荷兰白和考拉亲缘关系较近, 新西兰的胡以阿和铺地关系较近, 以上4个与澳大利亚的海发聚在一起为第2亚类, 其中除铺地为小叶型外, 其它3个品种都为中叶型; 而来自荷兰的雷托单独为第3亚类。说明这些白三叶品种的亲缘远近主要还是与地理区域及引种历史相关。

图1

Fig.1

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	图1 基于ISSR的15个白三叶品种聚类结果Fig.1 Cluster analysis of 15 white clover cultivars by ISSR

来自美国的瑞加与来自中国的鄂牧一号聚在一起后, 再与来自美国的拉迪诺、路易斯安那, 以及来自阿根廷的碧盛聚在一起形成第Ⅱ 大类。而鄂牧一号是以瑞加为原始材料选育而来, 聚类分析也证明这两个品种亲缘关系较近。美国与阿根廷均处于美洲大陆, 亲缘关系相对较近。

基于遗传相似系数, 对15个白三叶品种进行主成分分析, 位置相靠近者遗传距离较近(图2)。结果表明, 主成分分析结果和遗传聚类结果类似, 主成分分析结果更直观表明了15个白三叶品种之间的遗传关系。

图2

Fig.2

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	图2 基于ISSR的15个白三叶品种主成分分析Fig.2 The principal-coordinate analysis of 15 white clover cultivars by ISSR

测序结果得到ITS序列扩增长度从671~747 bp, 通过Genbank在线提交所获得的序列, 待审核完成后获得了NCBI中唯一的序列号, L₁-L₁₃登陆号为(KR914569-KR914581), L₁₄-L₁₅登陆号为(KR914586-KR914587)。

利用邻接法(NJ)构建系统进化发育树(图3), 可以将15个白三叶品种和苜蓿明显分为三大类。第Ⅰ 类有10个白三叶品种, 包含有来自丹麦的克朗德、米尔卡、百事和瑞文德, 同时也包含了澳大利亚的荷兰白、海法和考拉, 以及新西兰的胡以阿和铺地, 荷兰的雷托, 其中荷兰白和考拉亲缘关系较近; 第Ⅱ 类有5个白三叶品种, 包含有美国的拉迪诺、路易斯安那和瑞加, 同时也包含了中国的鄂牧一号和阿根廷的碧盛。苜蓿单独聚为第Ⅲ 类, 说明本研究结果可靠。ITS聚类分析结果与ISSR聚类分析结果类似。

图3

Fig.3

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	图3 基于ITS序列的15个白三叶品种系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 15 white clover cultivars based on ITS sequences

ISSR分子标记与ITS均将15个白三叶品种分为两大类, 且每一类包含的白三叶品种相似, 说明本研究结果可靠。而ISSR分子标记在分为两大类的基础上, 又将第Ⅰ 大类分为3个亚类, 分类更为具体。由于ISSR是一个高度可变的DNA区域, 可能产生更多的多态性条带^[16], 而白三叶ITS序列变异小, 造成了其品种间最小遗传距离偏小, 因此, 可以验证ISSR遗传分析结果的可靠性, ITS更适于研究科属的区分。ISSR标记能有效揭示核桃(Juglans regia)品种间的遗传多样性, 为核桃品种资源的种质鉴定和遗传亲本的选配提供了可靠的技术支撑和科学依据^[17]。刘峥和张汉尧^[18]利用ITS序列分析成功构建了旋花科14个属的的系统进化树。

ISSR和ITS聚类分析表明, 选择的白三叶品种具有一定的地域性分布规律, 并与引种历史具有较强的关联性。据记载, 白三叶的种植历史悠久, 16世纪后期, 荷兰开始用种子种植。17世纪传入英国, 随后传入美国、新西兰等国^[19]。来自丹麦、澳大利亚、新西兰和荷兰的白三叶品种聚在一起, 澳大利亚和新西兰都属于大洋洲, 由于地理关系聚在一起, 而后再与新西兰和丹麦聚在一起。而美国、阿根廷和中国的聚为一类, 推测是由于育种学家在育种过程中首先选择当地或者相近地区引进的白三叶种质材料进行白三叶新品种的选育, 但同时美国的瑞加和中国的鄂牧一号聚在一起, 则是由于鄂牧一号是在瑞加的基础上进行综合选育的, 而且鄂牧一号在国内推广面积不大, 变异较小, 还和原种保持着一定的亲缘关系。由于供试白三叶品种有限, 可以推测, 随着选择白三叶品种的增多, 将会有不同地区的白三叶因不同地区原种的选择而聚在一起。研究表明, 利用形态特征、SRAP、同工酶、ISSR进行遗传多样性分析能够将大部分地理区域临近的种质材料聚在一起^{[19, 20, 21]}。

在ISSR分类中, 首先是根据地理位置将白三叶品种聚为一类, 小叶型的瑞文德和大叶型的克朗德单独与中叶型白三叶百事和米尔卡共同构成了第1亚类, 说明亲缘关系与叶形大小相关性不是很强。

本研究表明, 白三叶品种的遗传关系与地理分布具有较大的相关性, 同时也与白三叶引种历史具有较强的相关性, 尤其栽培品种间的平均相似系数相对较大^[22], 在新品种选育过程中首先要考虑品种来源, 其次考虑白三叶的叶形等相关形态性状, 对目标性状进行选择育种。而同时ISSR和ITS均能有效地对白三叶品种遗传多样性进行分析, 且ISSR可以更加细致地对其进行分类, 以后可以在更多白三叶的相关研究中加以应用。