试验材料为披碱草, 于2014年8月在新疆沙湾县鹿角湾(43° 59'13″ N、85° 10'22″ E)野外采集, 经过镜检以及室内培养后检测带菌率均在93%以上, 采集后存放于冰箱中4 ℃保存。每次从中选取大小一致、籽粒饱满、无破损的披碱草种子为研究对象。

在实验室进行预实验时发现80 ℃高温处理5 d后披碱草种子已经完全不能发芽, 故试验所采用的最高处理温度为75 ℃。试验共设置3个温度梯度(60、70、75 ℃)和6个时间梯度(5、10、15、20、25、30 d), 共18个处理, 每个处理重复3次。将存放于冰箱中4 ℃保存的未经高温处理的种子作为对照(CK)。

1.3.1 种子处理方法 种子萌发和幼苗培养试验高温源为DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(共计3台), 额定电压220V-50Hz, 输出功率2 470 W。研究采取高温和时间结合的方式, 将试验种子从冰箱取出后均匀摆放在玻璃培养皿(直径为9 cm)正中央, 后置于干燥箱中, 温度过高可能影响种子的质量, 可在进行高温处理前将种子的含水量降低到4%以下^[15]。参照宋顺华和郑晓鹰^[15]安全有效的阶梯式方法逐步将处理温度从35 ℃提高至目标温度, 然后再进行阶梯式降温, 即:首先将温度调节至35 ℃处理24 h, 再调节温度至45 ℃处理24 h, 后将温度调节至所需温度处理相应天数, 最后降低温度至55 ℃处理24 h后, 将种子从干燥箱中取出后置于4 ℃冰箱中保存, 所有处理结束后进行萌发试验。

1.3.2 种子发芽和幼苗培养试验 采用SP X-300I-G型光照培养箱进行种子萌发。高温处理后及对照种子均用 50%硫酸软化颖壳30 min和次氯酸钠(有效氯浓度2%)表面消毒10~15 min, 且浸泡过夜后整齐摆放于内置滤纸(提前用去离子水湿润)、直径9 cm的培养皿中, 于25 ℃培养箱中黑暗萌发, 7 d后设置光照/黑暗8 h/16 h, 进行培养。每天对试验种子的发芽情况进行观察, 并分别统计开始发芽时间和每天发芽数, 以胚根长度超过2 mm视为发芽, 连续4 d没有新的发芽种子后计算最终发芽率^[16]。第12天时对萌发生长指标统计后, 将培养皿中的萌发种子转移到180 mm× 125 mm× 150 mm的塑料花盆中进行培养, 每天观察耗水状况并及时补加水、除杂草等。

1.3.3 种子带菌率的检测 达到预设温度处理后, 对种子先进行预处理^[17], 后进行消毒处理^[15], 之后每个处理随机选取20粒种子等距离置于含有100 mg· L^-1链霉素和100 mg· L^-1氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(ABPDA培养基)上, 每3个培养皿为一个重复, 每个处理3次重复, 30 d后统计菌落数并计算带菌率。过程中用到漂洗对照、印记(迹)对照、环境对照3种对照参照^[17]。

1.3.4 种子和幼苗带菌率的检测与验证 在种子发芽结束后的第50天之后所有的幼苗均长出新的分蘖, 对新生的分蘖逐株进行了镜检检测, 镜检过程中若镜检出一个分蘖带菌则认为此植株带菌; 同理, 镜检过程中若未镜检出一个分蘖带菌则认为此植株不带菌。另外, 为验证种子带菌率为0的处理组植株确实不带菌, 我们还就对照组的幼苗和高温处理组幼苗的叶片和叶鞘进行了内生真菌的分离培养, 以确保验证检测结果的准确性。叶片内生真菌的分离培养:取待检验新鲜叶片自来水冲洗4次后放入2%的次氯酸钠溶液中震荡5 min, 然后至于超净工作中无菌水冲洗5次并切成约1 cm长的片段后进行内生真菌的分离工作, 分离方法同种子内生真菌分离方法。镜检使用赵晓静等的光学显微镜法^[18]。

每天对试验种子的发芽情况进行观察, 分别统计开始发芽时间和每天发芽数, 并计算发芽率、发芽势、发芽指数和平均发芽天数等指标, 披碱草种子的发芽率(germination rate, GR)、发芽势(germination potential, GP)、发芽指数(germination index, GI)、活力指数(vital index, VI), 按照以下公式^[19]计算:

发芽率=最终正常发芽的种子粒数/供试种子粒数× 100%;

发芽势=在7 d内正常发芽的种子粒数/供试种子粒数× 100%;

发芽指数(GI)=∑ (G_t/D_t)。

式中:G_t为在不同时间的发芽数; D_t为相应的发芽日数。

活力指数(VI)=GI× S。

式中:S为12 d内幼苗长度(mm), GI为发芽指数。

试验结束时, 每重复随机选取10株, 用精度0.01 mm的数显游标卡尺(日本Mitutoyo, 型号500-173)测量胚芽长、胚根长, 用精度为万分之一分析天平称取幼苗鲜重。

第30天时记录每皿带菌种子数并拍照, 根据如下公式^[20]计算种子内生真菌带菌率:

带菌率=(带菌种子数/检测种子总数)× 100%。

对所有数据利用 Excel 2007统计和整理, 单因素方差分析和多重比较利用 SPSS 20.0软件, 并将结果以平均值± 标准误形式表示, 最终结果采用 Excel 2007制图。

随着温度的升高和处理时间的延长, 与对照相比, 内生真菌带菌率显著下降(P< 0.05)(图1), 高温处理对内生真菌的抑制作用逐渐增强(图2)。带菌率随着温度升高而显著下降的速度由快到慢为75> 70> 60 ℃; 随着处理天数的延长, 带菌率也明显降低, 其中, 60 ℃处理30 d带菌率降低为12.5%; 70 ℃处理20 d和75 ℃处理15 d后内生真菌带菌率分别降低到3.51%和2.78%; 之后分别在25和20 d时内生真菌带菌率为0。

图1

Fig.1

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	图1 不同处理温度下披碱草种子带菌率的变化 注:不同小写字母表示处理间差异显著(P< 0.05)。图3同。Fig.1 Effects of high temperature pretreatment on the Epichloё contamination rate of E. dahuricus seeds Note: Different lower case letter indicate significant difference at 0.05 level. The same in Fig.3.

图2

Fig.2

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	图2 75 ℃高温处理20 d下披碱草叶片中内生真菌带菌的变化Fig.2 The leaf of Epichloё of E. dahuricus treated by high temperature at 75 ℃ for 20 d

与对照相比, 高温处理显著降低了种子含水量(P< 0.05), 60 ℃时种子含水量为3.82%~5.25%, 各处理之间种子含水量无显著差异(P> 0.05), 但是均显著低于对照(表1); 70 ℃时种子含水量为2.94%~3.31%, 75 ℃时种子含水量为2.28%~3.58%。但70和75 ℃各处理时间之间无显著差异。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 高温处理对种子萌发的影响 Table 1 The effects of high temperature pretreatment on the germination of E. dahuricus seeds 处理 Treatment 种子含水量 Seed moisture content/% 发芽率 Germination rate/% 发芽势 Germination potential/% 发芽指数 Germination index 活力指数 Vigour index 10株幼苗鲜重 10 seeding fresh weight/g 60 ℃ 5 d 5.25± 0.001b 94.23± 0.33abcd 69.39± 0.11ab 3.70± 0.49bcde 0.076± 0.011bcde 0.206± 0.003ab 10 d 5.15± 0.001bc 85.24± 0.07bcdef 68.73± 0.06ab 3.11± 0.20cde 0.067± 0.005cde 0.214± 0.008a 15 d 4.51± 0.002bcd 97.92± 0.02ab 86.34± 0.06a 3.71± 0.29bcde 0.072± 0.006bcde 0.195± 0.009ab 20 d 4.03± 0.004bcde 93.44± 0.03abcd 69.33± 0.07ab 4.01± 0.33bcd 0.083± 0.008bc 0.207± 0.004ab 25 d 4.43± 0.001bcd 98.55± 0.01a 72.29± 0.01ab 3.51± 0.09bcde 0.075± 0.003bcde 0.213± 0.003a 30 d 3.82± 0.002bcde 93.33± 0.03abcd 87.50± 0.03a 3.86± 0.20bcd 0.082± 0.006bc 0.213± 0.011a 70 ℃ 5 d 3.04± 0.005de 97.53± 0.01ab 49.38± 0.04c 3.79± 0.36bcd 0.070± 0.008cde 0.183± 0.007bc 10 d 2.94± 0.003de 97.92± 0.01ab 80.88± 0.01a 3.86± 0.46bcd 0.078± 0.012bcd 0.200± 0.008ab 15 d 3.23± 0.003de 94.09± 0.00abcd 81.19± 0.05a 3.46± 0.46bcde 0.071± 0.007cde 0.207± 0.007ab 20 d 3.31± 0.004de 96.31± 0.00abc 68.74± 0.08ab 4.61± 0.21ab 0.099± 0.004ab 0.214± 0.003a 25 d 2.95± 0.005de 97.62± 0.01ab 54.76± 0.16bc 4.39± 0.57abc 0.087± 0.011abc 0.198± 0.003ab 30 d 3.17± 0.007de 90.32± 0.05abcde 53.74± 0.11bc 4.17± 0.39abc 0.070± 0.006cde 0.168± 0.008cd 75 ℃ 5 d 2.52± 0.003e 94.51± 0.03abcd 72.69± 0.10ab 3.80± 0.77bcd 0.077± 0.016bcd 0.202± 0.005ab 10 d 3.58± 0.003bcde 82.45± 0.09def 91.91± 0.04a 4.11± 0.60abc 0.084± 0.012bc 0.204± 0.008ab 15 d 3.40± 0.005cde 98.89± 0.01a 86.32± 0.04a 5.28± 0.16a 0.110± 0.003a 0.208± 0.004ab 20 d 2.93± 0.002de 100.00± 0.00a 74.21± 0.04ab 4.14± 0.24abc 0.084± 0.004bc 0.203± 0.005ab 25 d 2.40± 0.004e 84.02± 0.03cdef 4.84± 0.03d 3.11± 0.26cde 0.049± 0.005ef 0.159± 0.013d 30 d 2.28± 0.007e 80.00± 0.046ef 0.00± 0d 2.44± 0.15e 0.041± 0.003f 0.169± 0.001cd CK 8.24± 0.009a 73.33± 0.35f 42.67± 0.12c 2.76± 0.41de 0.051± 0.007def 0.188± 0.016abc Note:Different lower case letters indicate significant difference at 0.05 level. 注:不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。

表1 高温处理对种子萌发的影响 Table 1 The effects of high temperature pretreatment on the germination of E. dahuricus seeds

高温处理提高了披碱草种子发芽率, 促进了种子萌发。60 ℃时, 随着处理天数的增加发芽率升高幅度高低不齐, 但与对照相比整体呈现显著上升趋势(P< 0.05)。70和75 ℃时, 随着处理天数的增加发芽率呈现先降低后升高再降低的有规律的变化趋势, 分别在处理10和20 d时发芽率达到最大值。20 d时的发芽率大小为75> 70> 60 ℃, 但3个温度之间无显著差异(P> 0.05); 当处理天数超过25 d时, 各温度的发芽率会出现不同程度的下降趋势, 下降幅度大小为:75> 70> 60 ℃, 但处理时间为30 d时, 发芽率仍高于对照(表2)。这表明, 在一定的高温处理强度范围内, 低温长时或短时高温对发芽率有促进作用, 随着处理强度的加大这种促进作用逐渐减弱。

60 ℃高温处理较对照显著(P< 0.05)提高了种子发芽势, 60 ℃各时间处理之间无显著差异(P> 0.05), 随着处理天数的延长, 发芽势整体呈现上升变化趋势; 70和75 ℃时, 随着处理天数的增加发芽势呈现先升高后降低的变化趋势:70 ℃处理15 d发芽势最高; 75 ℃处理10 d发芽势上升且达到最大值, 但随着处理时间的延长, 发芽势下降。幼苗鲜重也呈现类似的变化。

60 ℃时各处理发芽指数与对照无显著差异(P> 0.05)。70 ℃时处理时间短于20 d时与对照无显著差异, 超过20 d时则显著高于对照(P< 0.05), 此后, 发芽指数随着处理时间的延长逐渐降低。75 ℃时, 随着处理天数的增加发芽指数呈现先升高后降低的变化趋势:处理15 d时发芽指数显著增加且达到最大值(P< 0.05)。活力指数也呈现类似的变化。

高温处理后芽长的变化(图3):60 ℃时芽长随处理天数的延长逐渐增长; 70和75 ℃时, 芽长随着处理时间的延长均出现先升高后降低的变化, 处理15 d时芽长达到最大值。高温可以促进芽生长, 这种促进作用的程度大小随温度的变化为60> 70> 75 ℃。

图3

Fig.3

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	图3 不同高温处理强度下的幼苗芽长和根长Fig.3 The hypocotyls length and radical length of E. dahuricus seedlings treated by high temperature at different time

高温处理后根长的变化(图3):60 ℃时各处理的根长与对照相比都有所增加, 无明显规律。70 ℃时根长随着处理时间的延长呈现先增加后降低的变化趋势, 处理15 d时根长达到最大值。75 ℃时根长随着处理天数的延长也呈现先增加后降低的变化趋势, 70 ℃处理5 d时根长达到最大值。