本研究以干旱敏感型白三叶‘ 拉丁诺’ (T. repens cv. Ladino)种子为试材, 供试种子来源于成都金种燎原种子有限公司。

1.2.1 渗透胁迫下白三叶种子萌发试验 选择两组籽粒饱满、大小一致的白三叶种子, 先经0.1%的HgCl₂消毒洗净后, 用蒸馏水浸泡1 h, 然后分别于Spd(浓度为20 μ mol· L^-1)和蒸馏水(作为对照CK)中浸泡2 h。该过程均在避光条件下进行。预处理的种子用蒸馏水反复冲洗数次后, 选取50粒分别接种于经等体积的0、10%、15%、20%(w/w)PEG-6000渗透液浸湿的双层滤纸的培养皿中, 每个处理4次重复。将培养皿置于光照培养箱中培养, 光周期与昼夜温度分别为12 h/12 h, 23 ℃/19 ℃, 光照强度为350 μ mol· (m²· s)^-1, 相对湿度为75%, 并定期添加等量相应浓度的PEG-6000溶液, 连续观察培养7 d, 根据植物生长调节剂促进/抑制种子萌发试验准则^[19]研究Spd浸种对不同浓度PEG-6000胁迫下白三叶种子萌发的影响。

1.2.2 白三叶幼苗抗旱试验 采用水培法培育白三叶幼苗。种子经HgCl₂消毒后, 均匀撒播在预先消毒的盛有石英砂的塑料育苗盆中, 于24 h光照培养箱中(与上述培养箱环境一致)进行萌发, 待种子出苗后更换为Hoagland’ s营养液继续培养至30 d(第2片成熟叶片完全展开)时进行处理。试验共设3个处理组:1)对照(CK), 使用Hoagland全营养液进行正常培养; 2)PEG, 使用含有20%(w/w)PEG-6000的Hoagland全营养液进行水分胁迫处理; 3)PEG+Spd, 向Hoagland全营养液中加入20 μ mol· L^-1 Spd后再加入20%(w/w)PEG-6000进行胁迫处理。每个处理4次重复, 分别于处理后的0、4、8、12、16 d取样测定相关生理指标。

1.3.1 种子萌发相关指标的测定与方法 于萌发后7 d时统计种子萌发相关指标。

萌发率(GR)=n/N× 100%,

式中:n为萌发种子总数, N为供试种子数。

萌发指数(GI)=∑ (G_t/D_t)。

式中:D_t为种子萌发数, G_t为相应萌发天数^[20]。

胚根长及单株鲜、干重的测定:于每个处理的4次重复中各取15株幼苗, 用直尺测量胚根长; 再用干净的吸水纸吸干表面的处理液, 称取鲜重, 然后将样品用锡箔纸包裹置于105 ℃烘箱杀青45 min, 再于75 ℃恒温72 h烘至恒重, 称取样品干重^{[21, 22]}。

1.3.2 幼苗抗旱生理指标测定与方法 白三叶幼苗叶片粗酶液的提取:取0.1 g白三叶叶片, 加入液氮用组织研磨机捣碎后, 加入1.5 mL预冷的磷酸缓冲液(150 mmol· L^-1, pH 7.0)和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)充分冰浴研磨, 4 ℃下15 000 r· min^-1离心20 min, 取上清液即为粗酶待测液, 用于SOD、POD、CAT、APX、MDA以及可溶性蛋白含量的测定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用核黄素-NBT法测定^[23], 过氧化物酶(POD)采用愈创木酚显色法测定^[24], 过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法进行测定^[22], 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性参照Nakano和Asada^[25]的方法测定, 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法测定^[26], 可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定^[27]。幼苗叶片相对含水量(RWC)采用烘干法测定并根据公式RWC=(鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)× 100%进行计算^[28]; 电解质渗透率(EL)采用电导率仪测定并根据公式^[29]:相对电导率=煮前电导率/煮后电导率× 100%计算。

每个试验处理随机设置4次重复。采用Excel 2003进行绘图与数据处理; SAS 8.0软件进行方差分析和显著性检验(P< 0.05)。用平均值± 标准误展示试验结果。种子萌发部分数据分析先分别对同一PEG浓度下不同处理进行单因素方差分析和多重比较, 然后对同一处理不同PEG浓度进行单因素方差分析和多重比较, 幼苗抗旱试验部分仅根据同一时间不同处理下的数据进行方差分析和多重比较。

2.1.1 白三叶种子发芽能力 正常条件下(PEG浓度为0), 经Spd浸种处理与未经浸种处理的白三叶种子萌发的各项生理指标均没有显著差异(P> 0.05)(图1)。渗透胁迫下, 白三叶种子萌发率和萌发指数随PEG胁迫强度的增大而显著降低(P< 0.05), 且下降幅度逐渐增大。与未经Spd浸种处理相比, Spd浸种均不同程度地提高了渗透胁迫下白三叶种子萌发的各项指标, 并在PEG浓度为10%和15%时达到显著影响(P< 0.05), 其萌发率和萌发指数较未浸种分别增高了3.6%、8.0%和4.6%、6.4%。当PEG浓度达到20%时, Spd浸种处理与未浸种处理之间已无显著差异(P≥ 0.05)(图 1)。

图1

Fig.1

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图1 亚精胺浸种对PEG渗透胁迫下白三叶种子萌发能力的影响 注:不同小写字母表示未浸种处理或者Spd浸种下不同PEG浓度间差异显著(P< 0.05), “ * ” 表示在同一PEG浓度下Spd浸种处理与未浸种处理间差异显著(P< 0.05)。图2同。Fig.1 Effects of seed-soaking with spermidine on seed germination of white clover under osmotic stress Note: Different lower case letters for no seed-soaking or Spd seed soaking indicate significant difference among different PEG concentrations at 0.05 level, and * indicate significant difference between no seed-soaking and Spd seed soaking under the same PEG stress treatment at 0.05 level. The same in Fig.2.

2.1.2 白三叶胚根长及幼苗单株鲜、干重 正常条件下(PEG浓度为0), Spd浸种处理能显著提高白三叶胚根长以及幼苗的单株鲜重(P< 0.05)(图2)。PEG渗透胁迫均不同程度降低了白三叶种子胚根长以及幼苗的单株鲜、干重, 并总体呈下降的趋势。随着PEG浓度的升高, 胚根长和幼苗单株的鲜重下降幅度较为明显, 幼苗干重下降幅度很小。Spd浸种处理有效提高了白三叶种子胚根长和幼苗鲜重, 尤其在15% PEG胁迫下, 较未浸种处理分别显著提高了20.46%和21.61%(P< 0.05), 而幼苗的干重几乎不受Spd浸种处理的影响, 除20% PEG胁迫处理外, 其它相同PEG浓度下浸种与未浸种间无显著差异(P≥ 0.05)(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 亚精胺浸种对渗透胁迫下白三叶种子胚根根长及单株鲜、干重的影响Fig.2 Effects of seed-soaking with Spermidine on root length, fresh weight and dry weight of white clover seedlings under osmotic stress

2.2.1 Spd对白三叶叶片相对含水量(RWC)的影响 PEG渗透胁迫显著降低了白三叶幼苗叶片的水分含量, 并随着胁迫时间的延长总体呈下降趋势(图3)。外源添加Spd可明显减缓渗透胁迫下叶片相对含水量的降低, 使植株在胁迫期间维持相对较高的水分含量, 在胁迫的8和12 d时, 与直接PEG胁迫相比, 外源Spd使白三叶叶片相对含水量分别提高了18.60%和27.44%(P< 0.05)。

图3

Fig.3

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	图3 亚精胺处理对渗透胁迫下白三叶叶片相对含水量的影响 注:不同小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.3 Effects of Spermidine on relative water content of white clover leaves under osmotic stress Note: Different lower case letters show significant difference among the different treatments at the same time at 0.05 level. The same below.

2.2.2 Spd对白三叶叶片电解质渗透率(EL)及丙二醛(MDA)含量的影响 PEG渗透胁迫下白三叶幼苗叶片电解质渗透率和MDA含量迅速升高, 而外源添加Spd可有效抑制这种趋势, 减轻渗透胁迫对细胞膜脂质的过氧化伤害, 维持细胞膜的完整性。渗透胁迫4、8、12和16 d时, 相比于直接PEG胁迫处理, 外源添加Spd条件下电解质渗透率分别降低了26.08%、56.60%、18.36%和26.65%, MDA含量分别降低了12.34%、24.72%、27.36%和30.81%(P< 0.05)(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 亚精胺处理对胁迫下白三叶叶片电解质渗透率和丙二醛含量的影响Fig.4 Effects of spermidine on electrolyte leakage and MDA content of white clover leaves under osmotic stress

2.2.3 Spd对白三叶叶片抗氧化酶活性的影响 外源Spd不同程度地影响了PEG渗透胁迫下白三叶叶片4种抗氧化酶的活性(图5)。渗透胁迫诱导SOD活性升高, 外源添加Spd进一步诱导其活性的增强。在处于渗透胁迫的4和8 d时, 外源添加Spd处理的SOD活性较直接PEG处理分别高出了12.39%和21.23%(P< 0.05)(图5)。随着渗透胁迫时间的延长, POD活性总体呈降低的趋势, Spd处理可以有效减缓其下降的速率, 使其POD活性显著高于直接PEG胁迫, 缓解了渗透胁迫对POD活性的抑制作用(图5)。PEG胁迫下, CAT活性随PEG浓度的升高, 呈先增高后降低的趋势, 在胁迫8 d时, 外源添加Spd处理的CAT活性显著高于直接PEG胁迫处理, 提高了14.59%(图5)。渗透胁迫诱导激活了APX的活性, 随着胁迫时间的延长, APX呈逐渐升高的趋势, 外源添加Spd进一步提高了APX的活性, 在胁迫的8 和12 d时较直接PEG处理分别增加了18.62%和23.86%(P< 0.05)(图5)。

图5

Fig.5

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	图5 亚精胺处理对渗透胁迫下白三叶叶片抗氧化酶活性的影响Fig.5 Effects of spermidine on antioxidant enzyme activities of white clover leaves under osmotic stress