分子标记是以生物个体间遗传物质内核苷酸序列差异为基础的, 是DNA水平遗传变异的直接反应。目前已建立了多种分子标记, 如以聚合酶链式反应(polymerase Chain Reaction, PCR)为基础的简单重复序列技术(simple sequence rRepeat, SSR)、简单重复序列区间DNA标记技术(inter-simple sequence repeats, ISSR)、随机扩增多态性DNA标记技术(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、甲基化敏感扩增多态性技术(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)(表1), 以及以分子杂交为基础的限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)和以DNA序列为基础的序列特异性扩增区技术(sequence-characterized amplified regions, SCAR)。由于直接以DNA形式表现, 不受时间空间的限制, 所以不存在表达与否的问题, 而且数量极多, 遍及整个基因组, 检测手段简单快速^[5], 因此得到了广泛的应用。遗传完整性指种质原始的遗传组成状态得到完全的保存^[6], 而在种子储藏的过程中, 老化不可避免, 进而导致DNA水平的变化, 遗传完整性会有不同程度的丧失, 因此分子标记技术在种子老化方面的应用主要集中在老化对遗传完整性的影响方面。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 主要分子标记技术的优缺点 Table 1 Merits and defects of the main molecular marker technologies 分子标记技术 Molecular marker technology 优点 Merit 缺点 Defect 简单重复序列技术 Simple sequence repeat 重复性好, 在基因组中随机分布, 标记数量多, 所需DNA 量少。 high repeatability; distributed randomly in genome; plentiful markers; need a small amount of DNA. 需要测序, 所需费用较多。 need sequencing; high cost. 简单重复序列区间 DNA标记技术 Inter-simple sequence repeats 引物设计较简单, 不需要预先知道基因序列, 所需DNA量少, 操作简单。 simple design of primers; do not need sequencing; need a small amount of DNA; simple to operate. 引物筛选具有相对的不随机性。 primers screening is not random. 随机扩增多态性DNA标记 技术 Random amplified polymorphic DNA 不需基因序列, DNA用量少, 不需要使用同位素。 do not need sequencing; need a small amount of DNA; do not need isotopes. 对反应的微小变化十分敏感, 重复性较差。 sensitive to tiny changes; low repeatability. 甲基化敏感扩增多态性技术 Methylation-sensitive amplified polymorphism 不需基因序列, 耗时少, 引物设计较简单。 do not need sequencing; less time-consuming; simple design of primers. 对非CCGG位点的胞嘧啶甲基化不敏感。 not sensitive to methylation at non-CCGG sites.

表1 主要分子标记技术的优缺点 Table 1 Merits and defects of the main molecular marker technologies

在种子老化领域, 组学研究多集中在使用转录组学或蛋白质组学的手段寻找种子老化相关基因、蛋白或生物学过程。

现阶段对基因功能的鉴定, 通常采取过量、减弱或终止某一基因的表达, 观察生物体的功能变化, 推测该基因的功能。基因功能鉴定技术一般可以分为转基因技术(transgenic technology)、基因敲除技术(gene knockout technology)和基因沉默技术(gene silencing technology), 基因沉默技术主要包括反义技术(antisense technology)和RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)。

脂质过氧化是种子老化劣变的主要原因, 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)是脂类氧化过程中的关键酶, 催化膜脂中的不饱和脂肪酸发生氧化, 主要底物是亚油酸和亚麻酸, 导致膜脂过氧化。LOX有很多种同工酶, 是一个庞大的基因家族, 不同的基因亚型在植物组织中的分布和作用也不相同, 近年来, 许多研究致力于寻找与种子老化相关的基因亚型。Dipak等^[48]首先利用RNAi技术证明了OsLOX1基因表达减少可以使人工老化的水稻种子保持活性, 在一定程度上抑制了老化进程, 之后又发现OsLOX1基因表达降低可以抑制种子储藏过程中类胡萝卜素的降解^[49]。黄浩雪^[50]从水稻中克隆了OsLOX2基因, 利用农杆菌介导获得了OsLOX2基因过表达水稻及两种干扰的转基因水稻(hpRNAi20-1和hpRNAi25-4), 过表达株系OsLOX2的表达量大约是野生型的2倍, hpRNAi20-1中OsLOX2的表达量是野生型的29%, hpRNAi25-4中OsLOX2的表达量是野生型的5%, 将这些转基因水稻的种子进行人工加速老化, 发现过表达植株的种子发芽率比野生型显著降低, 而在干扰株系中, hpRNAi20-1的发芽率比野生型高, hpRNAi25-4的发芽率比野生型低, 说明一定程度降低OsLOX2的表达可以抑制种子老化, 延长种子的寿命。Bai等^[51]利用RNAi技术得到的OsLOX3基因敲减的转基因水稻株系, 人工老化后, 其种子的发芽率比野生型高, 但表型没有明显差异, 说明OsLOX3基因表达降低可以有效抑制种子老化。磷脂酶D(phospholipase D, PLD)能够将膜中的磷脂降解, 参与种子储藏过程中膜的损伤。研究发现, 通过敲除或敲减拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtPLDa1基因, 抑制PLD的表达, 可以有效提高储藏后的种子的发芽率和油脂稳定性, 且AtPLDa1基因敲减的种子比AtPLDa1基因敲除的种子更耐储藏, 表明适当降低AtPLDa1的表达可以提高种子的耐贮藏能力^[52]。

种子贮藏过程中产生的活性氧ROS对基因组的损伤是导致种子老化劣变的重要原因之一, 其中一个显著的DNA损伤是产生8-氧鸟嘌呤核苷(7, 8-dihydro-8-oxoguanine, 8-oxo-G), 8-oxo-G可以在DNA复制过程中将胞嘧啶替换为腺嘌呤, 使GC碱基对转变为AT碱基对, 而拟南芥中的DNA糖苷酶基因AOGG1能够参与碱基对修复, 清除8-oxo-G。AtOGG1定位于细胞核, 过量表达AtOGG1的转基因拟南芥种子中, 8-oxo-G含量较野生型少, 人工控制劣变后转基因种子发芽率较野生型高, 说明AtOGG1通过清除8-oxo-G参与碱基对修复(图1), 提高了种子寿命^[53]。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]是参与DNA修复的核蛋白, 研究发现, 拟南芥中存在3种PARP基因亚型, 其中AtPARP3在种子中表达最多, 他们通过T-DNA插入的方法得到了缺乏AtPARP3的拟南芥突变体植株, 进行人工控制劣变后, 突变体植株的种子较野生型种子发芽延迟, 对不利的储藏条件更敏感^[54], 说明AtPARP3对种子贮藏和活力非常重要。

图1

Fig. 1

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	图1 AtOGG1参与DNA损伤修复的途径 注:ROS, 活性氧; 8-oxo-G, 8氧鸟嘌呤核苷; A, 腺嘌呤; T, 胸腺嘧啶; C, 胞嘧啶; G, 鸟嘌呤。Fig. 1 Pathway of AtOGG1 participating in DNA damage repair Note:ROS, reactive oxygen species; 8-oxo-G, 7, 8-dihydro-8-oxoguanine; A, adenine; T, thymine; C, cytosine; G, guanine.

ROS主要包括 O2-和H₂O₂, 其清除机制是种子老化研究的热点领域。细胞内清除ROS的系统包括酶促系统[过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、胱甘肽S-转移酶(GST)等]以及一些生物抗氧化剂(类胡萝卜素家族、维生素E类、抗坏血酸、谷胱甘肽和硫氧还蛋白Trx等)。SOD和APX是抗坏血酸-谷胱甘肽循环(图2)中的关键酶, SOD可以催化 O2-发生歧化反应, 将 O2-转化为H₂O₂和 O255; 随后, H₂O₂在APX的催化作用下, 与细胞内的一种重要自由基清除剂抗坏血酸AsA相互作用, 生成H₂O^{[56, 57]}。通过转基因技术得到过表达CuZnSOD和APX的烟草(Nicotiana tabacum)种子, 将其与非转基因烟草种子在室温、干燥的条件下储藏两年后发现, 与非转基因种子相比, 转基因种子发芽率较高, 相对电导率较低^[58], 说明过表达CuZnSOD和APX有利于烟草种子长期储藏。Trx是参与植物抗氧化胁迫的关键蛋白^[59], 采用转基因技术将源自蓝色黑鸭草(Phalaris coerulescens)的硫氧还蛋白S基因TrxS导入啤酒大麦(Hordeum vulgare), 得到过表达TrxS的转基因株系^[60]。将优良转基因品系Y002和非转基因大麦种子进行人工老化, 与非转基因种子相比, 转基因种子发芽率和发芽势的降低速率较慢, 丙二醛、羰基含量和相对电导率等较低, 抗氧化酶CAT和POD活性高^[61], 说明TrxS过表达能增强转基因大麦种子的抗老化能力。

图2

Fig. 2

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图2 抗坏血酸-谷胱甘肽循环 注:SOD, 超氧化物歧化酶; APX, 抗坏血酸过氧化物酶; MDHAR, 单脱氢抗坏血酸还原酶; DHAR, 脱氢抗坏血酸还原酶; GR, 谷胱甘肽还原酶; AsA, 抗坏血酸; MDHA, 单脱氢抗坏血酸; DHA, 脱氢抗坏血酸; GSH, 还原型谷胱甘肽; GSSG, 氧化性型谷胱甘肽; NADPH, 还原型辅酶Ⅱ ; NADP+, 氧化型辅酶Ⅱ .Fig. 2 The ascorbic acid-glutathione cycle Note:SOD, superoxide dismutase; APX, ascorbate peroxidase; MDHAR, monodehydroascorbate reductase; DHAR, dehydroascorbate reductase; GR, glutathione reductase; AsA, ascorbic acid; MDHA, monodehydroascorbic acid; DHA, dehydroascorbic acid; GSH, glutathione; GSSG, glutathione oxidized; NADPH, reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NADP+, nicotinamideadeninedinucleotide phosphate.

热激蛋白(heat shock proteins, HSP)是植物在高于其正常生长温度的条件下合成的新蛋白质, 与植物的高温等非生物胁迫关系密切, 近年来有研究涉及热激蛋白与种子老化的关系。分离自莲(Nelumbo nucifera)的一个小热激蛋白基因NnHSP17.5在拟南芥中异源过表达, 结果发现在人工加速老化后, 转基因拟南芥种子较野生型发芽率高, 且SOD活性较高, 证明了NnHSP17.5过表达有利于提高种子的抗老化能力, 在种子老化过程中起到了一定程度的抑制作用^[62]。还有研究利用转基因烟草证明了向日葵(Helianthus annuus)热激转录因子HaHSFA9能够提高小热激蛋白的含量, 提高种子活力^[63]。

种子在贮藏过程中发生老化是不可避免的, 引起种子老化的原因有很多, 国内外学者就此开展了大量的研究工作, 但仍旧没有从根本上揭示种子老化的机理。虽然分子生物学技术应用于种子老化研究领域的时间较晚, 但已经十分活跃, 也取得了不小的进展, 其中有关于遗传完整性的研究, 也寻找到了一些老化相关基因, 有待于进一步的鉴定和性状改良。基于现有的研究情况和存在的问题, 关于种子老化机制的研究, 可关注以下几个方面。

1)以往的研究多集中在活性氧自由基和一些老化相关酶的含量变化上, 以后可以加强对相关蛋白或mRNA定位的研究, 在组织水平或亚细胞水平研究种子老化的部位和轨迹。

2)已有一些组学研究初步找出了种子老化相关基因, 其中仅有小部分基因的功能已经得到验证, 但大多数基因仍有待于深入研究, 利用转基因等手段不仅可以在更深层次探究种子老化的机理, 而且有可能延长种子寿命。

3) 种子老化相关基因的功能得到验证后, 需要进一步研究其调控机理以及信号转导途径, 整合形成一个完整的调控网络, 解释种子老化的机制, 并找出更多解决种子老化的办法。