试验所用柱花草品种为热研2号、20号、21号, 于2015年8月至2016年1月期间采集于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带牧草试验基地。随机采集的材料剪碎后混合, 通过110 ℃杀青30 min后在65 ℃烘48 h, 粉碎后过0.45 mm筛制成样品, 均分为3个重复备测。

体外产气技术采用Zhao和Lebzien^[7]的培养液的配制方法和试验方法。

缓冲液Ⅰ :23.5 g Na₂HPO₄· 12H₂O、12.5 g NaHCO₃和11.5 g NH₄HCO₃溶于400 mL蒸馏水中; 缓冲液Ⅱ :23.5 g NaCl、28.5 g KCl、6.0 g MgCl₂· 6H₂O、2.63 g CaCl₂· 2H₂O溶于1 000 mL蒸馏水中; 混合培养液:取400 mL缓冲液Ⅰ 和50 mL缓冲液Ⅱ 混合, 然后加入蒸馏水使这种混合的缓冲液定容至500 mL。缓冲液Ⅰ 和混合培养液现用现配。

选择3头年龄和体重相近的成年海南黑山羊, 安装永久性瘤胃瘘管, 在上午饲喂前抽取瘤胃液, 经4层纱布过滤, 量取312.5 mL过滤后的瘤胃液置于预先加入了1 000 mL蒸馏水并在38 ℃水浴预热真空容器中, 然后加入250 mL预先配制好并在38 ℃水浴中预热的混合培养液, 并持续通入CO₂约10 min。称取柱花草干样0.2 g, 倒入提前称好重量的尼龙袋(3 cm× 5 cm)中绑紧后放入注射器前端。取30 mL瘤胃液-缓冲液的混合液加到每一个注射器中, 排净空气, 使其保持真空状态, 并封闭注射器口, 记录活塞的位置, 并在38 ℃的水浴摇床中培养。本试验设计在发酵开始后2、4、6、8、10、l8、24、30、36、48、72 h读取这11个时间点的产气量, 产气量为相应时间点的活塞的位置读数减去其初始位置读数和空白产气量。

制成的柱花草样品分析干物质(DM, %)、有机物(OM, %)、粗蛋白(CP, %)、粗脂肪(EE, %)、中性洗涤纤维(NDF, %)和酸性洗涤纤维(ADF, %), 其中DM、OM、CP、EE、NDF、ADF的分析参照张丽英^[8]的方法。体外产气试验结束后采集人工瘤胃液, 分析其氨氮(NH₃-N)含量及微生物蛋白(MCP)含量, NH₃-N含量测定采用凯氏定氮法^[9], MCP含量测定采用三氯醋酸(TCA)沉淀蛋白法^{[10, 11]}。

体外干物质消化率(IVDMD)=(样本质量-残渣质量)/样本质量× 100%;

饲料相对值(RFV)=DMI× DDM/1.29;

DMI=120/NDF;

DDM=88.9-0.779ADF.

式中:DMI(dry matter itake)为粗饲料干物质的随意采食量, 单位为占体重的百分比; DDM(digestible dry matter)为可消化的干物质, 单位为占干物质的百分比^[12]。

体外发酵参数采用模型GP=a+b(1-e^-ct)计算^[13], 将样品各时间点的产气量代入此模型, 根据非线性最小二乘法原理, 求出a、b、c值, 其中, a为快速发酵部分的产气量, b为慢速发酵部分的产气量, c为b的速度常数即产气速率, a+b为潜在产气量, GP为t时的产气量。

采用Excel 2003对数据进行整理, 并采用SAS 9.3软件包进行统计分析, 用平均值和标准误表示测定结果, 用Duncan法对各测定数据进行多重比较和交互作用分析。

不同品种对柱花草CP、EE、ADF、OM有显著影响(P< 0.05), 3个品种各营养成分之间存在一定的差异, 热研2号柱花草CP含量最高, 显著高于20号和21号(P< 0.05)(表1), 热研20号柱花草CP含量最低, 显著低于20号和21号; 3个品种EE含量差异均达到显著水平, 其中热研2号柱花草EE含量最高, 而21号含量最低; 热研2号柱花草ADF含量显著低于20号, 但与热研21号柱花草差异不显著(P> 0.05); 热研21号柱花草的OM值显著低于2号和20号; 3个品种柱花草DM、NDF和RFV值差异均不显著(P> 0.05)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 品种和生育期对柱花草营养成分的影响 Table 1 Influence of varieties and growing periods on the nutrients of Stylosanthes

表1 品种和生育期对柱花草营养成分的影响 Table 1 Influence of varieties and growing periods on the nutrients of Stylosanthes

不同生育期对柱花草CP、ADF、NDF和RFV有显著影响(P< 0.05), 柱花草不同时期各营养成分变化规律不同, 不同时期DM、EE、OM含量无显著变化(P> 0.05); 柱花草CP含量整体呈现先升高后降低的趋势, 初花期达到最高, 结实期降到最低, 其中初花期CP含量显著高于营养期和结实期(P< 0.05); 柱花草ADF及NDF含量随生长期的延长呈现升高的趋势, 二者均是在结实期达到最高且与其它各时期差异显著; 柱花草RFV值随生育期呈现下降趋势, 且各时期之间差异均达到显著水平。从交互作用结果来看, 品种和生育期之间仅有ADF、NDF和RFV值存在显著交互作用。

体外发酵试验结果表明(表2), 3个品种柱花草各体外产气参数和NH₃-N含量之间均无显著差异(P> 0.05), 对IVDMD和MCP影响显著(P< 0.05); 热研21号柱花草IVDMD值显著低于另外两个品种(P< 0.05); 热研21号柱花草MCP含量显著低于热研2号柱花草, 但与热研20号柱花草之间差异不显著。不同生育时期柱花草a值和c值无显著变化, b值和a+b值随生长发育时期呈现先升高后降低的趋势, 其中初花期b值显著高于营养期和结实期, 而初花期a+b值则显著高于其它各时期; 不同时期柱花草IVDMD值呈现下降趋势, 营养期IVDMD值显著高于结实期; NH₃-N含量以初花期最低, 但不同时期柱花草NH₃-N含量差异不显著; 柱花草营养期MCP含量显著高于结实期, MCP含量随生长发育时期呈现降低的趋势。交互作用结果显示, 柱花草品种和时期之间均无交互作用。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 品种和生育期对柱花草体外发酵参数及相关指标的影响 Table 2 The influence of varieties and growing periods on in vitro gas production parameters and related indexes of Stylosanthes guianensis

表2 品种和生育期对柱花草体外发酵参数及相关指标的影响 Table 2 The influence of varieties and growing periods on in vitro gas production parameters and related indexes of Stylosanthes guianensis

作为热带和亚热带地区常用的豆科牧草, 3个品种的柱花草平均CP含量都在12%以上, 这与Muamba等^[14]研究结果相近, 且与热带禾本科牧草相比, 柱花草的CP含量明显高于常用的热带禾本科牧草如王草(Pennisetum purpureum× P. typhoideum)、坚尼草(Panicum maximum)等, NDF含量也显著低于禾本科牧草^[15], 因而柱花草可以作为畜牧生产中的优质牧草。热研2号柱花草作为生产实践中经长期选择后的品种, CP和EE含量显著高于另外热研20号和21号, ADF含量显著低于热研20号柱花草, OM含量显著高于热研21号柱花草, 可以说在3个品种中营养价值最优, 这也是热研2号柱花草长期应用于生产实践并被大量种植的首要原因。热研20号和21号柱花草作为新品种的优势主要在于其抗炭疽病的特性, 在营养成分方面虽略低于热研2号柱花草, 但其RFV值之间差异均不显著, 也就保证其在生产中对动物的影响不会很大, 此外3个品种柱花草的开花时间不尽相同, 可以弥补单个品种在收获季节上的局限性。

柱花草CP含量随生育期呈现先升高后降低的趋势, 初花期CP含量达到最高值, ADF、NDF含量随生育期推进而不断升高, RFV值变化规律与纤维含量变化规律恰好相反, 随着生育期推进不断降低。营养期到初花期CP含量升高的原因可能是, 柱花草在此阶段叶片生长迅速, 叶子的总面积增大使得光合作用加强, 从而促进了氨基酸的合成^[16]。植物的营养物质主要集中在叶片, 茎秆主要起到支撑的作用, 随着生育期的延长, 柱花草茎不断伸长, 木质素和结构性碳水化合物含量不断增加, 因而CP含量降低, 纤维含量也不断增大^[17]。植物中 ADF、NDF 等纤维含量的升高, 适口性的变差和家畜采食量、消化率的降低, 动物机体对蛋白质、脂肪等营养成分的吸收利用也会因此产生影响^[18], 因此柱花草在营养期和初花期之间收获才能保证给家畜提供优质的营养供给。研究白三叶(Trifolium repens)不同生育期营养成分及其绵羊瘤胃降解动态结果表明, 不同生育期白三叶的NDF、ADF含量呈上升趋势, CP含量在开花期最高, 成熟期最低^[19], 该结果与本研究结果相似。

体外产气法是一种简便、经济、快速且可进行大量样品检测饲料营养价值的评定方法, 自Menke等^[20]首次试验成功后, 已经被广泛应用于饲料的营养价值评定^{[21, 22]}。本研究中不同品种柱花草体外产气参数之间无显著差异, 周汉林等^[23]应用体外产气法研究了10个品种柱花草的饲用价值, 结果发现柱花草各品种产气特性较为相似, 这与本研究结果一致。不同品种柱花草之间体外消化率和微生物蛋白产量情况略有差异, 热研21号柱花草体外消化率显著低于2号和20号, MCP产量显著低于热研2号柱花草, 但3个品种的氨氮含量差异不显著, 瘤胃液NH₃-N水平反映了蛋白质在瘤胃内的降解特性及微生物对NH₃-N的利用情况^[24], 本研究结果说明, 3个品种柱花草分别产生了3种不同状态的瘤胃微生物菌群平衡, 使得微生物对蛋白质的利用效率产生差异, 其中热研21号柱花草微生物蛋白合成效率最低, 其次为热研20号和2号柱花草, 而2号和20号之间差异不显著。

不同时期柱花草体外产气参数结果显示, 初花期慢速发酵部分的产气量和潜在产气量为4个时期中最高, 产气量主要取决于饲料底物发酵和挥发性脂肪酸的产量及其摩尔比例^[25], 饲料底物发酵主要是碳水化合物的发酵^[26], 其次是蛋白质和脂肪, 而产气量的多少不仅仅由这3种营养成分的含量决定, 也与营养成分的结构有很大关系^[27], 初花期潜在产气量高说明该时期柱花草的碳水化合物、蛋白质和脂肪等养分含量和质量达到了一个最佳发酵组合。体外干物质降解率体现了饲料在发酵体系中被微生物的降解程度, 不同时期柱花草体外消化率为营养期最高, 结实期最低, 且呈现下降趋势, 纤维含量随生育期不断升高, 纤维含量的升高是影响消化率的首要因素。NH₃-N是饲料中蛋白质降解和瘤胃微生物合成蛋白的中间产物, 其含量受饲料中蛋白含量、微生物合成效率等多种影响, 而微生物蛋白的合成量不仅受到NH₃-N含量的影响, 也与饲料中有机物发酵产生的能量有关^[28], 因而微生物蛋白含量随生育期的延长而不断降低的原因可能与其纤维含量的升高有关。