植物材料北细辛取自黑龙江省中医药大学药物园。由北细辛幼嫩叶柄诱导出愈伤组织, 继代培养时通过激素调控获得适于溶液培养的、松散的愈伤组织作为本研究的初始材料。

1.2.1 细胞悬浮培养体系的初步建立 取5 g愈伤组织, 用镊子夹碎后接种于装有100 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中进行振荡培养, 培养基为1/2MS+0.2 mg· L^-16-BA+0.9 mg· L^-1NAA, 蔗糖浓度为30 g· L^-1, pH 5.8。具体培养条件:培养温度(25± 2) ℃, 摇床转速为130 r· min^-1, 全天光照24 h。每7 d继代一次, 继代前先静置30 min, 更换2/3的培养液, 经过2~3次继代可初步形成稳定的悬浮细胞系。

1.2.2 接种量对悬浮培养细胞生长的影响 分别取1、2、3、4、5 g愈伤组织接种到含有100 mL培养液的250 mL锥形瓶中进行培养, 培养条件同上, 重复3次。

1.2.3 光照时间对悬浮培养细胞生长的影响 取愈伤组织2 g(本研究确定的最适接种量)接种到含有100 mL培养液的250 mL锥形瓶中进行培养, 光照时间分别为全天光照、全天黑暗、12 h光照12 h黑暗, 其他培养条件同上, 重复3次。

1.2.4 培养液量对悬浮培养细胞生长的影响 取愈伤组织2 g接种到含有70、100、130、160、190 mL培养液的250 mL锥形瓶中进行培养, 全天光照(本研究筛选出的最适光照), 其他培养条件同上, 重复3次。

1.2.5 转速对悬浮培养细胞生长的影响 取愈伤组织2 g接种到含有100 mL(本研究筛选出的最适培养液量)培养液的250 mL锥形瓶中进行培养, 摇床转速为110、130、150、170、190 r· min^-1, 其他培养条件同上, 重复3次。

1.2.6 蔗糖浓度对悬浮培养细胞生长的影响 取愈伤组织2 g接种到含有100 mL培养液的250 mL锥形瓶中进行振荡培养, 摇床转速为150 r· min^-1(本研究筛选出的最适转速), 其他培养条件同上, 重复3次。

1.2.7 外源激素浓度对悬浮培养细胞生长的影响 取愈伤组织2 g接种到含有100 mL培养液的250 mL锥形瓶中进行培养, 除外源激素浓度外, 其他培养条件同上。6-BA和NAA协同使用, 进行二因素三水平的正交试验, 各重复3次。

1.2.8 悬浮细胞生长曲线的绘制 在优化的最适条件下, 每瓶接种2 g, 共培养25 d, 每隔5 d取样称重, 每个处理3次重复, 取平均值。以培养时间为横坐标, 鲜重为纵坐标, 绘制生长曲线。

1.2.9 悬浮细胞形态的观察 于培养的不同时期, 用移液枪吸取培养物置于载玻片上, 在显微镜下观察细胞形态及细胞分散度。

采用Excel 2003对数据进行统计与分析, 以GraphPad Prism软件完成数据制图。

2.1.1 接种量对北细辛悬浮培养的影响 起始接种密度对悬浮细胞的生长有一定影响, 过大或过小的接种量都不利于悬浮细胞的生长。当接种量为1 g时, 悬浮细胞活力较低, 细胞生长缓慢; 接种量为2 g时, 细胞增殖较快, 悬浮细胞生长率显著增加(P< 0.05); 当接种量大于2 g时, 细胞生长变缓, 悬浮细胞生长率显著下降(图1)。这可能是由于培养液中的营养成分不能满足大量细胞生长。因此, 北细辛悬浮培养时, 在100 mL的1/2MS液体培养基中, 愈伤组织细胞的最适接种量为2 g。

2.1.2 光照对北细辛悬浮培养的影响 在不同的光照培养下, 细胞生长率和细胞状态有所不同(图1)。当为全天光照时, 细胞生长较快, 细胞生长量最高, 且褐化较少, 培养液清澈明亮透明; 当为12 h光照时, 细胞生长率略低, 出现一定褐化现象, 培养液呈浅褐色; 当为全天黑暗时, 细胞生长率最低, 而且在培养2 h内培养液全部变为褐色。

2.1.3 培养液量对北细辛悬浮细胞生长的影响 悬浮培养时, 需适宜的溶氧量以保证悬浮细胞的生长。培养液100 mL时, 悬浮细胞生长率最高, 显著高于70、130、160和190 mL培养液(P< 0.05), 是北细辛悬浮培养的最适宜装液量(图1)。当培养液量为70 mL时, 装液量较少, 导致细胞不能及时获取营养而生长缓慢; 当培养液量大于100 mL并逐渐增加时, 装液量较大, 影响氧气的供应, 致使细胞不易增殖, 悬浮细胞生长率逐渐降低。

图1

Fig. 1

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	图1 不同影响因素对悬浮细胞生长的影响 注:不同小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05)。Fig. 1 Effect of different influencing factors on cell growth in suspension cultures Note:Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level.

2.1.4 转速对北细辛悬浮培养的影响 摇床转速对悬浮细胞的增殖与生长有一定的影响(图1)。当摇床转速在110~150 r· min^-1时, 随着转速的增加, 悬浮细胞生长量逐渐增加。摇床转速为150 r· min^-1时, 悬浮细胞生长率最高, 细胞分散较好。但当摇床转速大于150 r· min^-1时, 悬浮细胞生长率开始下降, 可能是由于摇床转速过大时, 剪切力过大, 导致细胞损伤或破裂。

2.1.5 蔗糖浓度对北细辛悬浮培养的影响 当蔗糖浓度为30 g· L^-1时, 悬浮细胞生长率最高(图1)。当蔗糖浓度为25 g· L^-1时, 细胞生长较慢, 培养液变浑浊; 而蔗糖浓度大于30 g· L^-1并逐渐增加时, 悬浮细胞生长率逐渐降低, 不利于细胞的增殖生长, 这可能是由于较高的蔗糖浓度加大了培养基的渗透压, 不利于细胞吸收养分, 阻碍了细胞的生长。因此, 北细辛愈伤组织细胞悬浮培养时最适的蔗糖浓度为30 g· L^-1。

2.1.6 不同外源激素浓度配比对北细辛悬浮培养的影响 不同激素配比对悬浮细胞的生长和增殖有一定的影响(图1)。通过正交试验的直观分析法, 计算得出k_{6-BA 0.2}、k_{6-BA 0.4}、k_{6-BA 0.6}分别为0.510、0.585、

0.876, k_{NAA 0.3}、k_{NAA 0.6}、k_{NAA 0.9}分别为0.695、0.648、0.629, 说明就6-BA而言, 0.6 mg· L^-1为最适水平, 而NAA为0.3 mg· L^-1。由极差分析得出, R_6-BA为0.366, R_NAA为0.066, 因此说明对悬浮细胞生长影响最大的是6-BA。同时, 图1表明 0.6 mg· L^-1 6-BA与0.3 mg· L^-1NAA协同使用时, 悬浮细胞生物量最大。

图2

Fig. 2

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	图2 北细辛悬浮细胞生长曲线Fig. 2 Growth curve of Asarum heterotropoides suspension cells

北细辛悬浮培养时以25 d为一个周期, 悬浮细胞生长曲线基本为“ S” 形(图2)。悬浮培养初期0-5 d为滞后期(图3A), 细胞生长较缓慢; 5-15 d进入对数生长期(图3B), 细胞快速生长并在15 d时达到最大; 15 d后进入了停滞期(图3C和D), 细胞生长不再有明显变化, 此时悬浮细胞开始出现褐化, 有的甚至死亡, 培养液逐渐变浑浊。因此, 悬浮细胞的最佳收获时期为15 d。

图3

Fig. 3

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	图3 北细辛悬浮细胞生长过程 注:A, 悬浮培养初期(0-5 d); B, 悬浮培养对数生长期(5-15 d); C和D, 悬浮培养停滞期(15 d后)。Fig. 3 Growth process of Asarum heterotropoides suspension cells Note: A, Initial duration of suspension culture(0-5 days); B, Logarithmic growth phase of suspension culture(5-15 days); C and D, Stagnation period of suspension culture(after 15 days).

本研究建立的悬浮培养体系是由愈伤组织细胞团分裂成许多单细胞或多细胞聚合体(图4)。培养初期, 细胞呈现长条状, 有内含物(图5A), 生长较慢; 经过多次继代后, 可形成二、三或多细胞团(图5B和C), 并产生许多不同状态的单细胞:①较规则的圆球状, 内含物丰富(图5D); ②卵圆形, 内含物较少(图5E); ③不规则椭圆形, 内含物较丰富(图5F); ④草履虫状, 内含物较丰富(图5G); ⑤蝌蚪状, 内含物较少(图5H)。

图4

Fig. 4

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	图4 北细辛悬浮细胞整体分裂过程Fig. 4 Integral division process of Asarum heterotropoides suspension cells

图5

Fig. 5

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	图5 北细辛悬浮细胞形态 注:A, 培养初期的细胞; B和C, 多细胞团; D-H, 不同状态的单细胞。Fig. 5 Morphology of Asarum heterotropoides suspension cells Note:A, cells of the initial culture period; B and C, multicellular aggregates; D-H, single cell in different states.