2.1.1 乳酸菌的种类和数量 不同种类的乳酸菌其发酵能力不一样, 产生的发酵效果也不同。如戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)在发酵前期可迅速产酸, 降低青贮饲料pH , 抑制腐败菌生长, 而植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在环境pH为5以上时生长缓慢, 而在pH 为4以下的环境中能较好地生长, 所以戊糖片球菌常被拿来作为青贮发酵的启动菌, 而植物乳杆菌作为后期发酵的优势菌种^[13]。另一方面, 自然界中植物表面附生的乳酸菌数量有限, 因此, 在进行乳酸菌添加青贮时, 一定要保证其数量能满足发酵条件^[14]。蔡义民等^[15]研究得出, 常见牧草, 如紫花苜蓿(Medicago sativa)、全株玉米(Zea mays)等自然附着的乳酸菌数量每克不足10⁴个, 而要保证青贮过程中乳酸菌占主导地位, 需要每克原料至少有10⁵个以上的乳酸菌, 因此, 在青贮饲料中添加乳酸菌有助于青贮发酵快速进行。

2.1.2 活性及繁殖能力 作为青贮添加剂的优良乳酸菌必须具备较强的生长能力^[16], 乳酸菌活性直接影响乳酸菌是否能及时地在青贮过程中起作用, 乳酸菌活性强, 添加后复苏快, 很快进入发酵阶段, 抑制腐败菌的生长, 而普通乳酸菌, 活力较弱, 只能在相对受限制的环境中存活, 一旦脱离这些环境, 其自身也会遭到灭亡^[14]; 另一方面, 乳酸菌繁殖能力强, 可使青贮饲料中的乳酸菌数量迅速增多, 增强发酵, 反之, 则达不到预期效果。相关研究筛选得到的编号为31的优良植物乳杆菌在MRS液体培养基中培养12 h时, 其OD值超过0.3, 24 h时超过0.6, 36 h时超过0.8, 48 h时在1.0以上, 将其添加至垂穗披碱草(Elymus nutans)进行青贮后有效提高了青贮品质^[8]。

2.1.3 产酸和耐酸能力 乳酸菌产酸效率直接影响青贮过程中pH的变化速率, 产酸能力是衡量乳酸菌发酵能力的一个重要指标, 产酸速度快, 产酸能力强, 乳酸菌可迅速降低发酵前期青贮饲料pH, 抑制腐败菌生长, 减少饲料营养损失。而乳酸菌的耐酸能力直接影响青贮饲料后期发酵效果, 耐酸能力强, 乳酸菌在环境的pH下降到较低水平时仍能存活, 且具备发酵能力, 在后期发酵中所起的作用更突出, 对腐败菌的抑制作用更强, 更有利于优质青贮饲料的制作^[17]。在不同pH的MRS液体培养基中将乳酸菌培养3 d后发现, 乳酸菌不能在pH为3.0的环境生长, pH为3.5时部分乳酸菌可微弱生长, 但在pH为4.0、8.0、8.5、9.0的环境生长良好。选择在低pH环境中可生长且产酸速率快的植物乳杆菌作为优良乳酸菌进行10 ℃条件下垂穗披碱草90 d青贮后, 青贮饲料pH为5.15, 显著低于对照组的5.89^[8]。司丙文等^[18]通过对山竹岩黄芪(Hedysarum fruticosum)青贮饲料中乳酸菌进行分离鉴定后选出HF49, 其具有产酸性能好的特点, 可作为青贮乳酸菌添加剂的备选菌株。

2.1.4 糖源利用能力 乳酸菌以糖源为发酵底物产生乳酸以降低青贮饲料pH, 以及产生大量有益物质而提高饲料营养品质。研究表明, 乳酸菌广泛的糖源利用能力更有利于青贮饲料发酵。相关研究表明, 青藏高原乳酸菌具有更广泛的糖源利用能力^{[19, 20]}。且将利用糖源能力强的清酒乳杆菌添加至垂穗披碱草青贮90 d后, 青贮饲料pH降至4.42, 显著低于对照组4.53, 且氨态氮含量为16.81%, 显著低于对照组的19.73%^[20]。

乳酸菌的最适生长温度为35 ℃, 青藏高原高寒地区牧草收获期平均气温15 ℃左右^[20], 可选择耐低温乳酸菌添加剂进行添加青贮。但是考虑到青贮过程中的干物质损失, 青贮温度应控制在20~30 ℃, 不宜超过37 ℃, 当温度上升为40~50 ℃时, 乳酸菌活菌数会降低, 且易造成过多的干物质损失^[4]。青贮时, 青贮体系是否为无氧环境, 是决定青贮发酵过程中优势菌群的重要因素。如果青贮时密封不严, 空气大量渗入青贮饲料中, 一些好氧微生物就会大量繁殖, 与乳酸菌竞争发酵底物, 消耗大量养分, 导致青贮饲料腐败变质。目前, 国际规定拉伸膜裹包青贮饲料草捆密度要达到600 kg· m^-3才能为青贮创造较理想的厌氧环境, 我国目前最先进的打捆机可使草捆密度超过650 kg· m^-3, 创造的厌氧环境更为理想。而在窖贮^[21]中则要求压实密度为550~600 kg· m^-3。在青贮饲料生产中, 应尽可能增加青贮饲料密实度, 降低饲料中氧气含量, 以保证青贮饲料正常发酵。

2.3.1 水分 一般青贮对原料的水分要求为68%~75%, 但最适宜青贮的水分含量应为65%~70%, 水分含量过高, 一方面容易因汁液流失造成营养损失, 另一方面有助于梭菌(Clostridium prazmowski)的生长繁殖, 促进丁酸发酵, 降低青贮饲料品质^{[21, 22]}。水分过低有助于好气型腐败菌的生长, 且不易于压实, 同样不利于青贮饲料营养物质的保持。Touqir^[23]认为, 低水分青贮延缓了厌氧微生物的生长, 从而降低了其对易发酵糖分转换为有机酸的能力。

2.3.2 缓冲能 缓冲能是指植物抵抗pH变化的能力, 缓冲能是改变1 kg干物质, 使其pH从4达到6所用的碱的毫克当量^[14]。不同植物, 所含缓冲物质种类不同, 具备不同的缓冲能力。原料的缓冲能力和粗蛋白含量有关, 二者呈正比关系, 缓冲能越高, 粗蛋白含量也就越高, 青贮发酵时, pH越不易降低, 这样对蛋白质有强分解作用的梭菌将氨基酸通过脱氢或脱羧作用形成氨, 氨溶入水中形成弱碱, 使pH下降慢, 不利于乳酸菌发酵, 从而造成营养损失^[24]。有研究^[25]报道, 适宜水平的可溶性碳水化合物含量是克服高缓冲度、保证青贮发酵品质、获得高品质青贮饲料的条件。常见的玉米, 其缓冲能力弱, pH可急剧下降, 易做成优质青贮饲料。而苜蓿的缓冲能强, pH不容易降低, 所以苜蓿是最难做成青贮饲料的牧草之一。

2.3.3 含糖量 乳酸菌利用糖源发酵产生乳酸降低青贮饲料pH, 以保存更多的营养物质。一般而言, 作物秸秆中的水溶性碳水化合物含量应超过6%(DM)才可制成优质的青贮饲料, 当含量低于2%时不易制成优质青贮饲料^[26]。选择含糖量高的牧草作物与含糖量低的作物混和青贮则可以提高其青贮品质。将暖季型牧草象草(Pennisetum purpureum)与含糖量较高的豆科牧草大翼豆(Macroptilium lathyroides)混合青贮, 或将全株玉米与秣食豆(Glycine max)混和青贮, 都显著提高了乳酸含量, 使pH降至4.2以下, 且降低了丁酸和乙酸含量^{[27, 28]}。

国内外对青贮饲料乳酸菌的筛选研究已做了大量工作, 乳酸菌筛选技术已趋于成熟, 大多数青贮饲料乳酸菌的来源都是常见牧草表面附着的乳酸菌, 珠串球菌等。常见的青贮饲料乳酸菌筛选主要以新鲜牧草表面及青贮饲料中分离到的乳酸菌为筛选对象。从玉米, 甜高粱(Sorghum bicolor), 黑麦草(Lolium), 紫花苜蓿, 人工种植燕麦(Avena sativa)鲜样表面分离乳酸菌, 可得到戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus), 乳酸片球菌(Pediococcus lactis), 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei), 短乳杆菌(Lactobacillus brevis), 植物乳杆菌等菌种, 将筛选得到的优良菌株添加至紫花苜蓿及意大利黑麦草中分别在25和48 ℃进行青贮, 研究发现, 在25 ℃时, 所有乳酸菌添加青贮饲料的品质都显著优于对照组^{[29, 30]}。通过对青贮苜蓿和玉米中乳酸菌的分离、筛选和鉴定后可得到植物乳杆菌、短乳杆菌、魏斯氏菌(Weissella)等, 经筛选得到植物乳杆菌, 具有生长速度快, 产酸速率高的特点, 可作为潜在的青贮添加剂^{[31, 32]} 。对不同青贮阶段的青贮饲料进行微生物分离和鉴定, 采用16S rDNA序列对分离得到的乳酸菌分析后得知, 菌株分属肠球菌(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)^[33]。虽然大量的研究工作已筛选出很多的优良青贮饲料乳酸菌, 但是目前对优良乳酸菌的产业化应用和商品化生产工艺的研究并不多, 未来应加强对优良菌株生产应用方面的研究。

乳酸菌添加青贮制作不仅是目前青贮饲料加工中的热点, 也是未来青贮饲料生产中很重要的内容。针对同种作物青贮饲料添加乳酸菌可缩短青贮时间, 利于青贮玉米、青贮苜蓿、青贮燕麦等的青贮质量的提高^{[30, 34, 35, 36]}。其中豆科牧草青贮时加入乳酸菌, 可有效降低青贮料pH、氨态氮浓度, 减少干物质损失、酵母菌和霉菌数量^[28]; 不同含水量的紫花苜蓿添加乳酸菌后进行青贮, 结果青贮样品的pH下降加快, 同时保留了更多的粗蛋白^[35]; 燕麦青贮料pH低于3.8, 乳酸含量增多, 且保存更多的粗蛋白和干物质, 且家畜采食添加了乳酸菌的青贮饲料后, 其产奶量显著增高^{[36, 37]}。在青贮玉米秸秆中添加尿素和乳酸菌的混合物可显著提高青贮饲料品质^[38]; 向缓冲能值高, 直接青贮容易失败的苜蓿中, 添加乳酸菌和纤维素酶可有效提高苜蓿青贮品质和营养成分^[39]。不同作物混合青贮是常用的一种青贮调制办法, 在青稞秸秆和多年生黑麦草中添加乳酸菌可以促进乳酸菌早期发酵^[40]。针对不同的青贮饲料、青贮方式选择相对应的青贮饲料乳酸菌添加剂可有效提高青贮饲料青贮品质。

向水稻秸秆中添加单一乳酸菌(S-LAB)、复合乳酸菌(C-LAB)及绿汁发酵液(C-PEJ)(表1), 都有提高青贮饲料乳酸含量, 降低氨态氮含量, 减少饲料蛋白损失的趋势, 使饲料保存更多营养物质, 但影响幅度有所差异^{[4, 41]}。

将乳酸菌添加至不同的玉米青贮饲料中, 在青贮15 d时, 乳酸菌添加组和对照组相比, 其干物质含量差异不明显(表2)。而随着青贮时间延长, 乳酸菌处理组的乳酸含量高于对照组^{[42, 43]}。

我国幅员辽阔, 在青藏高原高寒地区, 普通的商品化乳酸菌青贮添加剂已不能适应当地气温, 往往会造成发酵不完全, 乳酸菌添加效果不显著等后果。所以, 结合低温条件, 发掘耐低温青贮饲料乳酸菌, 才能有效发挥乳酸菌添加剂优势, 提高青藏高原地区青贮饲料品质。对青稞秸秆青贮饲料中, 垂穗披碱草和藏北嵩草(Kobresia little dalei)表面的乳酸菌进行分离鉴定后, 可得到植物乳杆菌、戊糖片球菌、清酒乳杆菌、魏斯氏乳酸菌、肠明膜珠串球菌(Leuconostoc mesentercides)和短乳杆菌等菌种, 并对其生理生化特性进行研究后发现, 青藏高原乳酸菌耐低温、耐酸和耐盐性强的特点, 其中, 魏斯氏菌可在pH 3.0和9.5下生长, 表现出较强的耐酸碱性^{[19, 20, 42, 43]}; 纳木错藏嵩草表面分离得到的食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)和肠膜明串珠菌肠膜亚种N, 以及从德庆地区分离的魏斯氏菌, 均具有更强的产酸和更快的生长速率^[19]。在糖发酵方面, 青藏高原乳酸菌比同种商品乳酸菌可以利用更广的碳源^{[19, 20]}。挖掘青藏高原耐低温乳酸菌, 丰富乳酸菌种质资源库, 可推动高寒地区青贮饲料产业。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同处理的水稻秸青贮指标和干物质损失率情况 Table 1 Silage composition and dry matter loss composition 处理组 Treatment pH 乳酸 Lactic acid/% 乙酸 Acetic acid/% 丙酸 Propionic acid/% 氨态氮 Ammonia nitrogen/% 干物质损失率 Dry matter loss% 对照1 Control 1 4.38 3.02 0.97 0.43 7.72 4.13 C-LAB 4.01 5.89 2.69 0.41 7.13 2.23 S-LAB 4.09 3.68 1.07 0.42 7.51 3.13 对照2 Control 2 4.72 1.11 1.15 0.06 10.57 - C-LAB 4.73 1.15 0.42 0.05 9.33 - C-PEJ 4.62 1.22 0.05 0.05 8.92 -

表1 不同处理的水稻秸青贮指标和干物质损失率情况 Table 1 Silage composition and dry matter loss composition

注:C, 复合; S, 单一; LAB, 乳酸菌制剂, PEJ, 绿汁发酵液。数据来源于文献[4]和[41]。

Note:C, complex; S, single; LAB, lactic acid bactgeria preparation; PEJ, green juice fermented liquid. Data source: reference [4] and [41].

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 添加乳酸菌对玉米青贮过程中pH、干物质和乳酸含量变化的影响 Table 2 The effect of bacteria on the changes in pH, DM and LA contents of maze silages during ensiling 测定项目 Item 青贮天数 Ensiling day/d 玉米+多年生黑麦草 Maize and perennial ryegrass 玉米Maize 对照Control LAB 对照Control LAB 干物质 Dry matter/ (g· kg-1) 15 152.85± 7.95 156.17± 5.60 - - 30 139.87± 0.81 150.55± 6.74 - - 45 134.10± 15.51 145.99± 8.92 - - 60 - - 17.02± 4.21 17.80± 2.10 pH 15 3.91± 0.04 3.71± 0.06 - - 30 3.97± 0.02 3.76± 0.02 - - 45 4.07± 0.14 3.70± 0.04 - - 60 - - 3.59± 0.78 3.61± 0.62 乳酸 Lactic acid/ (g· kg-1) 15 54.07± 5.98 74.45± 13.22 - - 30 61.68± 10.71 98.08± 6.44 - - 45 85.05± 6.23 106.48± 10.28 - - 60 - - 40.30± 2.13 42.00± 1.34

表2 添加乳酸菌对玉米青贮过程中pH、干物质和乳酸含量变化的影响 Table 2 The effect of bacteria on the changes in pH, DM and LA contents of maze silages during ensiling

注; 数据来源于文献[42]和[43]。

Note:Data source: reference [42] and [43].

耐低温乳酸菌添加至垂穗披碱草青贮60 d后, 在低温处理15 ℃下, pH低于同温度对照组(表3); 干物质含量高于同温度其他处理; 有机酸含量相对较高, 且青贮效果优于25 ℃青贮, 具低温发酵优势^{[8, 14, 20]}。

将戊糖片球菌添加至垂穗披碱草青贮60 d后, 青贮体系中乳酸菌数量高于对照组(表4)。15 ℃下Q6添加组中酵母菌数量低于对照组, 在25 ℃下降为0^{[8, 20]}。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 戊糖片球菌添加至垂穗披碱草60 d青贮品质 Table 3 Ensiling quality of Elymus nutans silage with Pediococcus pentosaceus additive for 60 d 处理 Treatment 温度 Temperature/℃ pH 干物质 Dry matter/% 可溶性糖 Water soluble carbohydrate/% 乳酸 Lactic acid/% 乙酸 Acetic acid/% CK 10 6.12 28.46 17.00 2.30 2.93 15 5.75 27.33 11.5 1.94 1.34 25 5.82 29.12 8.93 3.87 2.10 Q6 10 5.10 27.80 7.59 6.39 2.80 15 5.00 29.32 7.28 10.11 3.86 25 5.12 28.22 7.05 8.51 3.51 CKLS 15 4.53 - 1.06± 0.02 7.85± 0.45 1.40± 0.02 25 4.56 - 0.99± 0.01 5.37± 0.07 1.38± 0.03 LS 15 4.42 - 1.39± 0.12 6.51± 0.06 1.24± 0.15 25 4.52 - 0.91± 0.08 7.33± 0.07 1.77± 0.13 CKLP+ Q6 15 4.76 - 1.01± 0.23 5.76± 0.01 1.55± 0.07 25 4.60 - 1.01± 0.17 5.27± 0.14 1.86± 0.24 LP+ Q6 15 4.69 - 0.87± 0.03 7.08± 0.07 1.63± 0.03 25 4.66 - 1.01± 0.04 5.73± 0.07 2.00± 0.04

表3 戊糖片球菌添加至垂穗披碱草60 d青贮品质 Table 3 Ensiling quality of Elymus nutans silage with Pediococcus pentosaceus additive for 60 d

注:CK为对照, Q6为戊糖片球菌, LS为清酒乳杆菌, LP为植物乳杆菌。下同。数据来源于文献[8]、[14]和[20]。

Note:CK stand for control, Q6 stand for Pediococcus pentosaceus, LS stand for Lactobacillus sakei, LP stand for Lactobacillus plantarum; similarly for the Table 4. Data source: reference [8], [14] and [20].

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 戊糖片球菌添加至垂穗披碱草青贮60 d微生物数量 Table 4 The microbes number of Elymus nutans silage added Pediococcus pentosaceus for 60 d 处理 Treatment 温度 Temperature/℃ 乳酸菌 Lactic acid bacteria/(log cfu· g-1) 酵母 Yeast/(log cfu· g-1) 霉菌 Mould/(log cfu· g-1) CK 10 8.43 2.62 2.00 15 8.34 3.92 2.54 25 8.19 3.85 2.48 Q6 10 8.82 3.29 2.08 15 8.83 2.82 2.25 25 8.47 0 2.00

表4 戊糖片球菌添加至垂穗披碱草青贮60 d微生物数量 Table 4 The microbes number of Elymus nutans silage added Pediococcus pentosaceus for 60 d

注:数据来源于文献[8]和[20]。

Note:Data source: reference [8] and [20].

3.5.1 同型发酵乳酸菌的单独添加和混合乳酸菌添加 将植物乳杆菌单株菌和由植物乳杆菌, 凯氏乳酸菌(; actobacillus casei)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)组成的复合菌, 分别添加至水稻秸秆进行青贮后发现, 添加复合乳酸菌的水稻秸秆青贮效果最好, 营养价值最高, 且布氏乳杆菌的加入有效保持了青贮饲料的有氧稳定性^[4]。复合乳酸菌添加可保护苜蓿青贮饲料中更多的真蛋白不被溶解, 向草坪屑中添加复合菌剂则可以改善其发酵品质, 将草坪屑制成优质青贮饲料^{[44, 45]}。

3.5.2 乳酸菌制剂和其他菌种混合添加 由于不同菌剂其发酵性能不同, 所以添加不同菌剂对青贮饲料青贮品质影响很大。目前, 青贮添加剂一般都是植物乳杆菌和其他菌剂混合添加, 常见的乳酸菌添加有植物乳杆菌和片球菌的混合添加^[46]; 由于屎肠球菌(Eterococcus faecium)有利于青贮饲料的初期发酵, 所以常用来和乳酸菌搭配进行复合菌剂添加; 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以产生淀粉酶, 复合纤维素酶等, 可以将多糖分解成单糖, 为乳酸菌的生长提供更多的碳源, 所以枯草芽孢杆菌也经常和乳酸菌混合做复合添加剂^[24]。

3.5.3 乳酸菌和纤维素酶混合添加 纤维素酶就是一类可以将纤维素分解成单糖或者寡糖的蛋白质, 在分解纤维素的过程中起生物催化作用。目前, 我国进行青贮的牧草大多数含有较高的纤维素含量, 尤其是一些禾本科牧草, 如果对刈割时间掌握不合适, 其纤维含量过高, 会影响饲草的适口性。而豆科作物苜蓿作为一种优质牧草进行青贮时, 存在糖含量低, 不利于青贮发酵的问题。添加纤维素酶可以有效分解纤维素, 一方面降低纤维素含量, 提高适口性; 另一方面, 纤维素被分解得到的单糖可以为乳酸菌的生长提供充足的碳源, 为乳酸菌的大量繁殖提供有利条件^[47]。向紫花苜蓿中添加纤维素酶和乳酸菌进行青贮, pH快速下降, 青贮完成以后, 可溶性糖含量仍继续增加^[48]。