1.1.1 植物材料 植物材料为陇东苜蓿(Medicago sativa cv. Longdong), 由甘肃省检验局提供。

1.1.2 供试菌种 供试菌种为根内球囊霉(Glomus intraradices), 由中国农业科学院提供; 供试根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae), 购自中国农业大学根瘤菌中心。

1.1.3 供试土壤 供试土壤为沙土。草炭土于高压灭菌锅中121 ℃灭菌1 h, 隔天再灭菌1 h, 自然风干; 河沙过2 mm筛, 200 ℃干热灭菌6 h, 然后将草炭土和河沙以重量比3:1混匀, 装在密封袋中备用。原始供试土壤pH为6.43(水:土=2.5:1)。

采用模拟酸性土壤的方法, 通过土壤中添加硫酸的方法将土壤pH调节至4.43、5.06、6.43和7.16。装入盆口直径× 盆底直径× 高(17 cm× 11 cm× 15 cm)的塑料盆, 每盆装土1.9 kg, 共计64盆。播种前, 每个pH处理下16盆, 接种AMF根内球囊霉、接种苜蓿中华根瘤菌、同时接种AMF和根瘤菌以及不接菌, 各4盆。

菌根接种剂的接种方法为层播, 接种量为每盆接种20 g菌剂, 接种AM真菌的处理加入含有孢子、菌丝的土壤及其寄主植物的根段混合物作为接种物, 未接种的处理加入20 g灭菌的沙子作为对照。接种根瘤菌的方法为将供试菌株先接到YMA斜面活化, 25 ℃恒温培养3 d, 然后转接于YMA培养液(1 000 mL)的三角瓶中, 震荡(转速为150 r· min^-1, 25 ℃, 30 h)培养至对数生长期(OD₆₀₀=0.816), 配制成菌悬液(菌数约109 cuf· mL^-1), 间苗后采用根灌法接种, 即用注射器将8 mL根瘤菌菌液注射于芽根处, 不接种的对照注射8 mL无菌水。

播种前, 紫花苜蓿种子用10%(质量分数)的H₂O₂浸泡10 min, 而后用无菌水(高压灭菌锅121 ℃下灭菌20 min)清洗3遍, 然后将种子摆放于含有湿滤纸的培养皿内(直径9 cm), 每皿摆放100粒, 置于25 ℃恒温培养箱培养48 h, 将催芽后的种子均匀播在每盆土壤中, 每盆种6粒。待幼苗长7 d后间苗, 每盆留4株长势一致并且茁壮的幼苗。

紫花苜蓿生长期间均隔日添加土壤重量10%的Long Ashton溶液, 保证紫花苜蓿生长所需的养分。Long Ashton营养液组成及含量为:2 mmol· L^-1 K₂SO₄, 1.5 mmol· L^-1 MgSO₄· 7H₂O, 3 mmol· L^-1 CaCl₂· 2H₂O, 0.1 mmol· L^-1 FeEDTA, 4 mmol· L^-1(NH₄)₂SO₄, 8 mmol· L^-1NaNO₃。

试验在兰州大学榆中校区智能温室开展, 试验期间, 温度为23~28 ℃(昼) , 20~25 ℃(夜), 光照强度为180~850 mmol· (m²· s)^-1(生长期5月-8月)。出苗后第2周, 隔天记录紫花苜蓿生长速度; 自第4周起, 每周测量一次自然株高及分枝数, 种植70 d收获。

收获时, 将地上部分沿土表剪下, 称鲜重, 取0.5 g用于测定生理指标, 其余部分105 ℃杀青30 min后置于70 ℃烘干至恒重, 称干重, 计算干鲜比, 换算出地上生物量。

地下部分洗净后用直尺测量根长, 随后分两份, 一份用来测定菌根侵染率, 另一份置于70 ℃烘干至恒重, 称干重, 计算干鲜比, 换算出地下生物量。

根冠比以地上干重/地下干重计算得出。

菌根侵染率的测定采用根段法^[20]。称取约0.1 g的根, 剪成大约1 cm的小段, 放入装有10%KOH的试管中, 80 ℃水浴20 min, 用1%HCl洗涤, 再用蒸馏水冲洗干净; 用0.065%苯胺蓝染液在80 ℃水浴中染色10 min, 洗净后用甘油保存并在解剖镜下镜检^[21]。

采用SPSS 19.0软件进行统计分析, 测定结果用平均值± 标准误表示; 采用JMP IN 4 进行方差分析; 采用Microsoft Excel 2013作图。

pH对紫花苜蓿的株高无显著影响(P> 0.05)(表1)。与不接菌和单独接种根瘤菌处理相比, AM真菌和同时接种AM真菌和根瘤菌均显著提高了紫花苜蓿的株高(P< 0.05), 同时接种AM真菌和根瘤菌共同处理的株高高于单独接种AM真菌处理的株高, 但二者差异不显著(图1)。表明在本研究条件下, AM真菌促进了紫花苜蓿的生长。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同土壤pH、苜蓿中华根瘤菌根瘤菌(S)、AM真菌(AM)及三者之间的互作效应方差分析(P) Table 1 ANOVA results (P) for effects of soil pH, Sinorhizobium medicae (S), arbuscular mycorrhizal fungi (AM), and their interactions (pH× S, pH× AM, S× AM, pH× S× AM) on the listed variables 指标 Parameter 方差分析Source of variation 互作效应Interactions pH S AM pH× S pH× AM S× AM pH× S× AM 株高Plant height ns 0.004 6 < 0.000 1 ns ns ns ns 分枝数Branching factor 0.023 0 ns < 0.000 1 ns ns ns ns 地上生物量Shoot biomass ns 0.000 6 < 0.000 1 ns ns 0.006 6 ns 地下生物量Root biomass < 0.000 1 0.000 3 < 0.000 1 ns < 0.000 1 0.001 1 ns 根长Root length 0.022 8 ns < 0.000 1 ns ns ns ns 根冠比Root to shoot ratio < 0.000 1 ns < 0.000 1 ns 0.035 2 ns ns 菌根侵染率Colonization rate 0.026 5 0.049 7 < 0.000 1 ns 0.026 5 0.049 7 ns Note:ns indicate no significant difference at the 0.05 level. 注:ns表示无显著影响(P> 0.05)。

表1 不同土壤pH、苜蓿中华根瘤菌根瘤菌(S)、AM真菌(AM)及三者之间的互作效应方差分析(P) Table 1 ANOVA results (P) for effects of soil pH, Sinorhizobium medicae (S), arbuscular mycorrhizal fungi (AM), and their interactions (pH× S, pH× AM, S× AM, pH× S× AM) on the listed variables

图1

Fig.1

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图1 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿株高 注:不同小写字母表示同一pH不同处理间差异显著(P< 0.05), N代表不接种, S代表接种根瘤菌, AM代表接种丛枝菌根真菌, AMS代表同时接种根瘤菌和丛枝菌根真菌; 下同。Fig.1 Alfalfa plant height under different pH values, inoculation of AM, rhizobia, both, or neither Note: Different lower case letters for the same pH indicate singificant difference among different treatments; N, no inoculation; S, inoculated with Sinorhizobium medicae; AM, inoculated with Glomus intraradices; AMS, co-inoculated with G. intraradices and S. medicae. The same below.

pH对紫花苜蓿的分枝数有显著影响(P< 0.05)(表1)。与不接菌处理相比, 单独接种AM真菌和同时接种根瘤和AM真菌均显著提高了不同pH下紫花苜蓿的分枝数(P< 0.05), 提高幅度为87.50%~200.56%, 但二者之间无显著差异(P> 0.05)(图2)。单独接种根瘤菌未显著促进紫花苜蓿分枝数, 表明在本研究条件下, AM真菌是促进紫花苜蓿生长的主要因素。

图2

Fig.2

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	图2 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿分枝数Fig.2 Alfalfa branching number under different pH, inoculation of AMF, rhizobia, both, or neither

pH对紫花苜蓿的地下生物量有显著影响(P< 0.05), 对地上生物量无显著影响(P> 0.05)(表1)。与不接菌处理相比, 单独接种AM真菌和同时接种AM真菌和根瘤菌的处理对紫花苜蓿地上、地下生物量的积累都具有显著促进作用(P< 0.05)(图3、图4), 紫花苜蓿地上生物量提高了727.78%~1 737.50%, 地下生物量提高了1 120%~3 000%, 表明AM真菌和根瘤菌显著提高了紫花苜蓿的生产力, 而且接种对地下生物量的促进大于对地上生物量的促进。单独接种根瘤菌的处理地上、地下生物量与对照组相比差异显著, 表明根瘤菌在一定程度上促进了紫花苜蓿的生长。同时接种AM真菌和根瘤菌的处理地上、地下生物量都高于单独接种AM真菌的处理, 但差异不显著, 表明AM真菌和根瘤菌同时存在对植物的生长具有显著的促进作用, 这与之前的研究结果一致^[19]。

图3

Fig.3

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	图3 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿地上生物量Fig.3 Alfalfa shoot biomass under different pH, inoculation of AMF, rhizobia, both, or neither

图4

Fig.4

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	图4 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿地下生物量Fig.4 Alfalfa root biomass under different pH, inoculation of AMF, rhizobia, both, or neither

pH对紫花苜蓿的根长有显著影响(P< 0.05)(表1)。与其它pH相比, pH为4.43的土壤条件下紫花苜蓿的根长反而有所提高(图5), 这可能是紫花苜蓿通过增加根长来加强对养分的吸收进而减轻酸胁迫的危害。与不接菌处理相比, 单独接种AM真菌和同时接种根瘤和AM真菌均显著提高了紫花苜蓿的根长(P< 0.05)。表明酸胁迫对紫花苜蓿的影响在于改变根的形态, 接种AM真菌在一定程度上缓解了酸胁迫的影响, 促进了紫花苜蓿的生长。

图5

Fig.5

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	图5 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿根长Fig.5 Alfalfa root length under different pH, inoculation of AMF, rhizobia, both, or neither

图6

Fig.6

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	图6 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿根冠比Fig.6 Alfalfa root to shoot ratio under different pH, inoculation of AMF, rhizobia, both, or neither

pH对紫花苜蓿的根冠比有显著影响(P< 0.05)(表1)。在pH为4.43和5.06的土壤条件下, 紫花苜蓿的根冠比较小, 表明低的土壤pH在一定程度上抑制了紫花苜蓿地上部分的生长, 促进了紫花苜蓿地下部分的生长, 这与根长增加的结论是一致的。与不接菌处理相比, 单独接种AM真菌和同时接种根瘤和AM真菌均显著提高了紫花苜蓿的根冠比, 且后者的根冠比大于单独接种真菌的处理。表明在本研究条件下, 真菌在一定程度上缓解了酸胁迫对紫花苜蓿生长的影响, 促进了紫花苜蓿的生长。

未接种AM真菌的土壤中没有检测到丛枝菌根真菌侵染紫花苜蓿根部, 而在接种AM真菌的土壤中菌根侵染率在40%~50%(图7)。pH为4.43的处理下菌根侵染率低于其它pH处理条件下的菌根侵染率, 表明低土壤pH抑制了真菌的侵染。试验中虽然没有观测到根瘤, 但是在菌根侵染率方面, 同时接种根瘤和AM真菌提高了侵染率, 表明根瘤菌的存在有利于AM真菌的侵染。

图7

Fig.7

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	图7 不同pH、AM真菌和根瘤菌处理下紫花苜蓿菌根菌侵染率Fig.7 Alfalfa AM colonization under different pH, inoculation of AMF, rhizobia, both, or neither

不同土壤类型具有不同的物理、化学及生物学特性^[22], 使得同一植物在不同土壤上具有不同的生长特性^{[23, 24]}。pH为4.43和5.06的土壤都属于强酸性土壤, 6.43的土壤属于弱酸性土壤, 7.16的土壤属于中性偏碱土壤, 4种土壤酸度差异是造成紫花苜蓿生长差异的诱因。

在本研究中, 分枝数、地下生物量、根长、根冠比、菌根菌侵染率在不同土壤pH处理条件下存在差异, 说明酸对紫花苜蓿造成了胁迫, 低的土壤pH不利于紫花苜蓿的生长。强酸性土壤条件下紫花苜蓿的根长有所提高, 表明酸对紫花苜蓿的影响在于改变根的形态, 根变细了, 容易受微生物病害的侵染, 主根吸收少, 影响苗期的生长, 进而又促使苜蓿根伸长, 以获得充足的养分维持生长的需要。但是土壤pH为5.06时紫花苜蓿的根长最小, 低于其它的处理, 说明在酸处理大于5而小于7的土壤环境中, 根系长度与pH水平之间可能呈显著的正相关, 土壤环境酸性较弱, 植物的根系越长, 这与李剑峰等^[25]的研究结果一致。

在本研究中根冠比随土壤pH的降低而减小, 且pH为4.43土壤处理条件下幼苗的根冠比低于pH为5.06土壤处理条件下的根冠比, 这可能是由于根部对酸胁迫的敏感程度大于茎叶, 所以低pH处理下根冠比的下降主要是地上部生物量虽然有一定的增加量, 但地下部几乎停止生长所致^[26]。就不同pH条件下的生长速度而言, 土壤pH为4.43时的生长速度是最快的, 随着土壤pH的升高, 生长速度有所减缓, 这可能是因为低的土壤pH值能够促进土壤养分以可利用状态释放出来, 刺激紫花苜蓿的生长^[27]。

酸胁迫并未对紫花苜蓿的生长造成显著的影响, 可能是因为本研究采用的是通过向土壤中添加硫酸的方法调节土壤pH, 而在生长过程中不断添加营养液导致硫酸被稀释, 所以到了后期收获的时候酸并未对紫花苜蓿的生长造成明显的胁迫, 出现这一现象的主要原因可能是紫花苜蓿在弱酸土壤下面临的主要胁迫因素是土壤中的铝、铁离子, 酸性本身对植株的胁迫作用较微弱^[28]。但在实际生长条件下, 土壤中存在的较多的H⁺为亚铁离子和铝离子的活化提供了条件, 放大了铁、铝离子对植株的伤害。而铝毒害通常被认为是影响酸性土壤中植物生长的重要因素。铝能够引起植株体内Ca、Mg、P、K等元素的缺失, 铝浓度的增加会进一步造成Al-P沉淀, 从而导致植物可利用的土壤磷含量受到限制。

接种AM真菌后, 紫花苜蓿的株高、分枝数、地上和地下生物量、根长、根冠比都有显著的提高, 即使在低土壤pH条件下紫花苜蓿也能生长得较好, 表明接种AM真菌能够缓解酸胁迫, 促进紫花苜蓿对营养物质的吸收, 进而增加生物量的积累。研究表明, 接种AM真菌可以增加蚕豆(Vicia faba)对土壤中磷、氮元素的吸收^[29]。因此, 初步认为, 接种AM真菌降低了酸胁迫对紫花苜蓿的元素吸收的抑制, 促进了紫花苜蓿的生长和生物量的提高。接种根瘤菌后, 紫花苜蓿的生长没有显著提高, 但是在株高、地上生物量、地下生物量方面, 接种根瘤菌的处理与不接种处理相比存在差异。本研究中紫花苜蓿结瘤数很少, 几乎没有, 而有研究表明, 过低的土壤pH会直接影响到豆科植物根瘤菌的存活, 导致宿主侵染被抑制, 土壤中矿质元素的作用也可能被严重影响, 从而造成共生固氮体系间接地被抑制^[30]。pH低于5.0的情况下即使接种根瘤菌, 苜蓿的固氮效率也非常低^{[31, 32, 33, 34]}, 因此, 没有结瘤可能是因为酸性土壤抑制了根瘤菌的生长, 本研究所用苜蓿中华根瘤菌可能不适宜在酸性土壤中生长。有研究认为, 相比接种根瘤菌的影响, 土壤环境能更显著地影响紫花苜蓿的生长, 但接种根瘤菌对紫花苜蓿的生长有一定的促进作用^[35], 这与本研究得出的结论基本一致。

同时接种AM真菌和根瘤菌的处理, 株高、分枝数、地上、地下生物量、根冠比、菌根菌侵染率都高于单接种AM真菌的处理, 说明接种根瘤菌能够促进AM真菌发挥作用, 同时接种同样可以提高菌根侵染率, 根瘤菌促进AM真菌发挥作用的机制还有待于进一步研究。