试验地位于华南农业大学教学实验基地, 23° 14' N, 113° 38' E, 属亚热带季风气候。年平均气温21.6 ℃, 温度最高为7月, 月平均气温29.4 ℃; 温度最低为1月, 月平均气温13.3 ℃。年平均温度为21.6 ℃, ≥ 10 ℃年积温7 910.9 ℃· d, 年平均降水量为1 967.8 mm, 年平均太阳辐射值为4 367.2~4 597.3 MJ· m^-2, 年平均日照时数为1 707.2 h。

大麦品种为西引2号饲用大麦, 由河南省顺民意种业有限公司提供。于2011年12月10日种植, 设3个种植小区, 每个小区面积为3.0 m× 4.0 m, 大麦播种量为180 kg· hm^-2。播种前每个小区施用肥料为复合肥(N∶ P₂O₅∶ K₂O=15∶ 6∶ 8), 其中施用N、P₂O₅和K₂O分别为45.0、18.0和24.0 kg· hm^-2。

在抽穗期、开花期、乳熟期和蜡熟期, 每个小区分别随机取1个1.0 m× 1.0 m的样方刈割后测产。大麦材料于2012年4月20日早稻插秧前刈割完毕。

将各收获期刈割后的大麦样品后带回实验室, 切短至20~30 mm, 取200 g左右样品装入信封袋, 采用70 ℃烘箱干燥48 h后测定饲草干物质含量^[8], 之后粉碎过0.45 mm筛备用。粗蛋白含量采用凯氏定氮法(定氮仪 KDN-103F, 上海纤检仪器有限公司)测定; 粗脂肪含量采用乙醚提取法测定(SLF-06, 杭州托普仪器有限公司); 粗灰分含量采用灼烧法测定^[8]; 水溶性碳水化合物(water soluble-carbohydrates, WSC, %)含量采用蒽酮-硫酸法测定^[9]; 缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定^[10]; 粗纤维、中性洗涤纤维NDF, %)和酸性洗涤纤维(ADF, %)含量采用改进的滤袋分析法测定(ANKOM A-200i 北京)^[11]; 干物质消化率采用纤维素酶人工消化试验法测定^[12]。

相对饲用价值(relative feed quality, RFQ)由以下公式计算得出^[13]:

RFQ = DMI× DDM/1.29.

式中:DMI为单位体重家畜的粗饲料干物质随意采食量(%); DDM为可消化的干物质占干物质总量的比例(%)。DMI与DDM的预测模型分别为:

DMI =120/NDF;

DDM=88.9-0.779× ADF.

乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量分别采用MRS琼脂培养基(MRS agar medium, MRS)、营养琼脂培养基(nutrient agar, 广东环凯微生物有限公司)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, 广东环凯微生物有限公司)计数^[14]。乳酸菌在厌氧条件下(YQX Ⅱ 型厌氧箱, 上海新苗医疗器械制造有限公司)37 ℃培养2~3 d; 好氧细菌、酵母菌和霉菌在有氧条件下37 ℃培养2~4 d。

将不同刈割期的大麦切短为20~30 mm后分别混匀, 充分混匀后添加不同的乳酸菌制剂, 再次充分混匀后装入30 cm× 20 cm的聚乙烯青贮袋中, 每袋200 g, 用真空打包机(SINBO Vacuum Sealer)抽真空后密封, 置于暗处, 室温贮藏60 d。青贮发酵品质分析、有氧稳定性分析均用此材料。试验设对照(CK)、添加乳酸菌L. plantarum CCZZ1和L. parafarraqinis ZH1, 添加量为1.0× 10⁵ cfu· g^-1鲜样, 每个处理3次重复。

发酵品质分析:在青贮袋开封后, 取20 g混匀的青贮饲料放入聚乙烯塑料封口袋中, 加入80 mL蒸馏水, 置于4 ℃冰箱里浸泡18 h后过滤, 期间适当摇晃, 用pH计(PHS-3C, 上海鹏顺科学仪器有限公司)测定浸提液pH值。氨态氮(NH₃-N)含量用凯氏定氮仪直接蒸馏测定。有机酸含量采用Agilent 1100型高效液相色谱仪测定(色谱柱RSpak KC-811昭和电气, 流动相为3 mmol· L^-1的高氯酸溶液, 流速1 mL· min^-1, 柱温60 ℃, 检测器为SPD-20A紫外检测器, 检测波长210 nm)。

青贮饲料V-Score 评分:V-Score评分体系^[15]是以青贮饲料中的NH₃-N和挥发性脂肪酸(VFA)含量的多少来评定发酵品质的优劣, 满分为100分。根据这个评分体系可以将青贮饲料品质分为良好(> 80分)、尚可(60-80分)、不良(< 60分)3个级别。

青贮饲料有氧稳定性分析:青贮袋开封后, 无菌操作混匀样品, 然后取出一部分进行发酵品质分析, 剩下的样品不封口放置, 进行有氧稳定性分析。分别于开封后48、96、144和192 h取出袋中已混匀样品20 g, 测定pH。pH上升幅度越小则说明其有氧稳定性越好, 反之则越差。

采用Excel 2007和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析评价生育期对大麦的产量和营养价值的影响, 采用双因素方差分析评价生育期和乳酸菌对大麦的青贮发酵品质的影响, 用Duncan法对发酵品质参数的均值进行多重比较, 显著性检测水平为0.05。

随着生育期的推进, 大麦的干物质产量显著增加(P< 0.05), 在蜡熟期达到最高, 为6.58 t· hm^-2(表1)。从抽穗期至乳熟期, 大麦粗蛋白产量显著增加, 在乳熟期达到最大值(0.64 t· hm^-2), 之后显著下降(P< 0.05)。大麦干物质消化率和相对饲用价值在乳熟期达到最大值, 分别为63.84%和107.19, 显著高于其它3个生育期(P< 0.05), 之后显著降低(P< 0.05)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同生育期大麦产量、消化率及饲用价值 Table 1 Yields and relative feed quality (RFQ) of barley at various stages of maturity 生育期 Growth stage 干物质产量 Dry matter yield/t· hm-2 粗蛋白产量 Crude protein yield/t· hm-2 干物质消化率 Dry matter digestibility/% 相对饲用价值 RFQ 抽穗期Heading 3.94± 0.21d 0.53± 0.02d 52.69± 2.22c 82.44± 1.02d 开花期Flowering 5.01± 0.69c 0.60± 0.05b 57.50± 1.38b 97.58± 2.54c 乳熟期Milk 5.87± 0.45b 0.64± 0.02a 63.84± 2.59a 107.19± 1.61a 蜡熟期Dough 6.58± 0.83a 0.56± 0.04c 59.10± 0.92b 102.81± 2.25b 注:同列不同小写字母表示不同生育期间差异显著(P< 0.05)。 Note: Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different growth stage at the 0.05 level.

表1 不同生育期大麦产量、消化率及饲用价值 Table 1 Yields and relative feed quality (RFQ) of barley at various stages of maturity

随着生育期的推进, 大麦植株的干物质和无氮浸出物含量显著增加(P< 0.05), 而粗蛋白含量显著降低(表2)。从抽穗期至乳熟期, 大麦水溶性碳水化合物含量显著提高(P< 0.05), 乳熟期达到最大值(14.43%), 之后显著下降(P< 0.05)。大麦中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量从抽穗期到乳熟期显著降低(P< 0.05), 之后又增加。各个生育期大麦植株附着的乳酸菌数量没有显著差异(P> 0.05), 均少于10⁵ cfu· g^-1 FM。抽穗期大麦植株水分含量高, 且水溶性碳水化合物含量显著低于其它3个生育期(P< 0.05)。蜡熟期大麦缓冲能较大(104.29 mE· kg^-1 DM), 酵母、霉菌数量较多。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同生育期大麦营养成分与微生物组成 Table 2 The chemical and microorganism composition of barley harvested at different stages 项目 Item 抽穗期 Heading stage 开花期 Flowering stage 乳熟期 Milk stage 蜡熟期 Dough stage 干物质DM/% 13.21± 0.39d 16.91± 0.28c 25.87± 0.52b 30.07± 0.89a 粗蛋白CP/% 13.41± 0.50a 11.93± 1.13b 10.94± 0.69b 8.57± 0.49c 粗脂肪EE/% 4.24± 0.24a 4.10± 0.04a 3.33± 0.30b 4.17± 0.11a 粗纤维CF/% 36.95± 1.02a 34.32± 0.90b 31.08± 0.65c 29.66± 1.20c 粗灰分Ash/% 9.58± 0.16a 8.57± 0.37b 8.13± 0.03c 7.77± 0.07c 无氮浸出物NFE/% 35.84± 1.64c 41.08± 1.47c 46.50± 1.19b 50.84± 1.32a 中性洗涤纤维NDF/% 66.80± 1.02a 59.17± 0.84b 55.69± 1.07c 58.15± 0.56b 酸性洗涤纤维ADF/% 38.13± 1.47a 34.44± 0.70b 31.75± 1.29c 32.05± 1.19c 水溶性碳水化合物WSC/% 7.64± 0.28d 9.76± 0.11b 14.43± 0.26a 8.31± 0.13c pH 6.03± 0.07c 6.14± 0.04bc 6.32± 0.09a 6.19± 0.09ab 缓冲能Buffering capacity/mE· kg-1 DM 64.01± 3.57b 71.12± 4.96b 72.12± 3.07b 104.29± 6.71a 乳酸菌Lactic acid bacteria/lg(cfu· g-1 FM) 4.50± 0.08a 4.56± 0.18a 4.39± 0.43a 4.66± 0.27a 细菌Bacteria/lg(cfu· g-1 FM) 7.34± 0.09c 7.57± 0.08bc 8.76± 0.26a 7.81± 0.24b 酵母菌Yeast/lg(cfu· g-1 FM) 5.38± 0.25b 5.27± 0.05b 5.52± 0.16ab 5.72± 0.12a 霉菌Mold/lg(cfu· g-1 FM) 4.23± 0.40b 4.18± 0.16b 4.00± 0.30b 5.03± 0.23a 注:FM, 鲜物质; cfu, 菌落形成单位; lg, 菌数取以10为底的对数; 同行不同小写字母表示不同生育期间差异显著(P< 0.05)。 Note: FM, Fresh matter; cfu, Colony-forming units; lg, Denary logarithm of the numbers. Different lowercase letters within the same row indicate significant difference among different growth stage at the 0.05 level.

表2 不同生育期大麦营养成分与微生物组成 Table 2 The chemical and microorganism composition of barley harvested at different stages

生育期对大麦青贮饲料各项青贮指标均有极显著影响(P< 0.01), 添加乳酸菌对除了丙酸外的其它青贮指标均有极显著影响(P< 0.01), 对丙酸无显著影响(P> 0.05); 二者的互作对丙酸有显著影响(P< 0.05), 对其它指标有极显著影响(P< 0.01)(表3)。除了抽穗期外, 其它3个生育期青贮大麦的pH均小于或等于4.2, 且青贮饲料中没有检测到丁酸。随生育期的推进, 大麦青贮饲料pH和NH₃-N含量均显著降低(P< 0.05)。与CK组相比, 添加CCZZ1青贮饲料中乳酸含量显著增加(P< 0.05), NH₃-N含量则显著降低(P< 0.05), 同时显著降低抽穗期大麦青贮饲料中丁酸含量(P< 0.05)。相对于CK组, 添加ZH1对抽穗期和开花期大麦青贮饲料pH并无显著影响(P> 0.05), 反而使乳熟期和蜡熟期青贮饲料pH显著上升(P< 0.05)。除抽穗期外, 其它3个生育期青贮饲料中添加ZH1后, 乙酸含量显著增加(P< 0.05), NH₃-N含量则显著降低(P< 0.05), 但效果不及添加CCZZ1。随着生育期推进, 大麦青贮饲料V-Score得分显著增加(P< 0.05)。其中, 乳熟期和蜡熟期大麦青贮饲料得分均超过80分, 青贮品质良好, 添加CCZZ1后大麦青贮品质更佳。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同生育期大麦青贮发酵品质 Table 3 Effects of Lactic Acid Bacteria (LAB) on fermentation quality of barley silage in different growth stages 生育期 Growth stage 乳酸菌处理 LAB treatment pH 乳酸 Lactic acid/% 乙酸 Acetic acid/% 丙酸 Propionic acid/% 丁酸 Butyric acid/% NH3-N/ %TN V-Score 抽穗期 Heading CK 4.68± 0.12a 3.76± 0.21f 6.52± 0.19bc 1.91± 0.05a 1.23± 0.13a 16.93± 1.07a 40.90± 1.02g CCZZ1 4.70± 0.05a 8.07± 0.23c 6.00± 0.58c 1.65± 0.24ab 1.04± 0.13b 11.77± 1.42c 66.28± 1.14e ZH1 4.67± 0.14a 2.13± 0.11g 6.99± 0.55b 1.97± 0.41a 0.78± 0.11c 15.47± 0.48b 53.15± 0.92f 开花期 Flowering CK 4.15± 0.13b 5.83± 0.20d 2.81± 0.20f 1.05± 0.05d 0.00± 0.00d 15.23± 1.00b 66.53± 0.88e CCZZ1 3.77± 0.11d 9.42± 0.39b 3.82± 0.45de 1.14± 0.03d 0.00± 0.00d 7.67± 0.16e 90.50± 1.36b ZH1 4.20± 0.06b 4.82± 0.29e 8.51± 0.68a 1.29± 0.02c 0.00± 0.00d 10.20± 0.67d 79.82± 1.01d 乳熟期 Milk CK 3.97± 0.08c 6.01± 0.66d 3.14± 0.64ef 1.65± 0.30ab 0.00± 0.00d 9.44± 0.78d 84.23± 0.95c CCZZ1 3.69± 0.05d 10.79± 0.69a 3.00± 0.08f 1.43± 0.19bc 0.00± 0.00d 4.65± 0.40h 91.85± 1.52ab ZH1 4.12± 0.06b 2.28± 0.22g 6.76± 0.50bc 1.14± 0.19c 0.10± 0.03d 7.47± 0.45ef 83.34± 1.13c 蜡熟期 Dough CK 3.95± 0.06c 5.47± 0.36de 2.57± 0.18fg 1.23± 0.08c 0.00± 0.00d 6.57± 0.33f 89.75± 1.04b CCZZ1 3.71± 0.08d 8.46± 0.93c 1.86± 0.24g 1.19± 0.10d 0.00± 0.00d 4.74± 0.52h 92.90± 0.99a ZH1 4.17± 0.12b 2.25± 0.42g 4.49± 0.32d 1.48± 0.10bc 0.00± 0.00d 5.39± 0.66g 89.47± 1.14b 显著性 Significance 生育期 Growth stage * * * * * * * * * * * * * * 乳酸菌 LAB * * * * * * NS * * * * * * 生育期× 乳酸菌 Growth stage× LAB * * * * * * * * * * * * * 注:同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05)。* 与* * 分别显著(P< 0.05)和极显著(P< 0.01)影响, NS表示无显著影响(P> 0.05)。 Note: Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different treatment at the 0.05 level.* and * * indicate significant effect at the 0.05 and 0.01 level, respectively; NS indicate no significant effect at the 0.05 level; CCZZ1, Lactobacillus plantarum CCZZ1; ZH1, L. parafarraqinis ZH1; TN, Total nitrogen.

表3 不同生育期大麦青贮发酵品质 Table 3 Effects of Lactic Acid Bacteria (LAB) on fermentation quality of barley silage in different growth stages

抽穗期和乳熟期CK组大麦青贮饲料暴露于空气144 h后pH开始急剧上升, 开封192 h后pH均在6.0左右, 而开花期青贮饲料在开封48 h后pH开始缓慢上升, 好气变质开始; 蜡熟期CK组青贮饲料在开封192 h内, pH没有显著变化, 好氧稳定性较好(图1)。开花期至蜡熟期CCZZ1组青贮饲料pH在开封48 h后开始显著上升, 其中乳熟期青贮饲料pH上升幅度最大。各个生育期CCZZ1组青贮饲料在暴露于空气192 h后, pH均接近甚至超过7.0, 好气变质严重。添加ZH1的各生育期大麦青贮饲料在开封192 h内的有氧条件下, pH变化不大, 有氧稳定性较好。

图1

Fig.1

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	图1 有氧条件下不同乳酸菌添加处理大麦青贮饲料pH变化Fig.1 pH changes in barley silages after exposure to air under different lactic acid bacteria addition treatments

随着生育期的推进, 大麦的干物质含量与干草产量逐渐增加, 这是由于在成熟过程中, 麦类饲料作物所含籽实比例不断增加; 同时, 由于干物质不断积累, 其植株干物质产量逐渐提高。

不同生育期的全株大麦营养特性差别很大。本研究中, 随着生育期的延长, 大麦植株的粗蛋白和粗纤维含量降低, 这可能与成熟过程中作物光合作用逐渐减弱密切相关^[16]。大麦植株中大量的水溶性碳水化合物逐渐向籽实转移, 并以淀粉的形式储存下来。因此, 植株中水溶性碳水化合物在乳熟期达到最高值, 之后快速下降, 这与Filya^[17]、Xie 等^[18]对不同生育期全株小麦(Triticum aestivum)营养成分变化的研究结果一致。本研究中, 乳熟期和蜡熟期全株大麦的RFQ值均超过100, 且乳熟期作物RFQ值显著高于其它3个生育期。这是由于这两个成熟期的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量低, 特别是乳熟期最低, 因而依公式计算出的粗饲料干物质的随意采食量和可消化的干物质含量都高。

目前, 关于麦类饲料作物最佳收获时期存在不同的研究结果^[19]。本研究表明, 从抽穗期到乳熟期, 大麦植株中粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均呈下降趋势, 说明乳熟期大麦相对饲用价值显著高于其它3个时期, 但其干物质产量不及蜡熟期。因此, 从产量和营养价值方面考虑, 刈割冬闲田种植的大麦最佳时期为乳熟期至蜡熟早期。

本研究中, 随着生育期推进, 大麦青贮饲料pH和NH₃-N含量显著降低, 除抽穗期外, 其它3个生育期青贮饲料中均没有检测到丁酸, 发酵品质显著提高。从抽穗期至乳熟期, 大麦青贮饲料中乳酸含量显著增加, 之后显著降低, 这主要是由于蜡熟期植株的水分含量和水溶性糖含量较低。因为适宜的含水量也是青贮饲料制作的关键因素^[20]。尽管蜡熟期全株大麦水溶性糖含量较低, 但仍然能够保持良好的青贮发酵品质, 在对小麦青贮品质的研究中^{[6, 17]}也得到类似结果。一般来说, 促进乳酸发酵是成功调制青贮饲料的关键。在厌氧条件下, 当青贮原料水分、缓冲能和水溶性糖含量适宜时, 植株本身附着的乳酸菌大量繁殖, 使青贮饲料pH迅速下降, 同时抑制有害微生物的生长^[21]。接种乳酸菌特别是产酸能力强的同型发酵乳酸菌对于提高饲草的青贮发酵品质经济有效, 添加同型乳酸菌的青贮饲料乳酸含量增加, pH和NH₃-N含量显著降低^{[22, 23]}。本研究中, 添加植物乳杆菌CCZZ1增加了各生育期乳酸含量、降低了pH和NH₃-N含量, 显著提高了青贮发酵品质。同时, 乳酸菌的添加效果也受青贮原料特性的影响^{[24, 25]}。开花期、乳熟期和蜡熟期添加CCZZ1的青贮效果优于抽穗期, 主要是开花期、乳熟期和蜡熟期大麦的干物质和水溶性糖等含量较高。添加类谷糠乳杆菌ZH1降低了抽穗期和开花期大麦青贮饲料的丁酸和NH₃-N含量, 提高了抽穗期和开花期大麦的青贮品质。添加ZH1未能提高乳熟期和蜡熟期大麦的青贮品质, 这是由于乳熟期和蜡熟期大麦青贮饲料的pH低于4.0, 丁酸和氨态氮含量较低, 发酵品质较好; 此外, ZH1是异型发酵乳酸菌, 提高发酵品质的效果不及同型发酵乳酸菌CCZZ1。

本研究中, 添加CCZZ1虽然促进了乳酸发酵, 提高了大麦青贮品质, 但却加速了各生育期大麦青贮饲料的好氧变质。特别是在开花期和乳熟期, 添加CCZZ1的青贮饲料在开封后96 h内pH明显升高, 好氧变质严重, 这可能与大麦所处生育期植株原料中WSC含量和青贮饲料中乳酸含量较高、挥发性脂肪酸含量较低有关。刘秦华^[26]研究了王草(Pennisetum purpureum× P. glaucum)、玉米秸秆、小麦和燕麦(Avena sativa)等不同青贮材料特性与有氧稳定性之间的关系, 结果表明, 原料中WSC含量与青贮饲料的有氧稳定性显著负相关, WSC含量越高, 青贮饲料越容易发生有氧变质; 另外, Muck和Kung^[27]指出添加同型发酵乳酸菌之所以会降低青贮饲料的有氧稳定性, 是因为青贮过程中挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量较少; 同时, 当青贮饲料开封后, 无氧环境变成了有氧环境, 好氧细菌、霉菌和酵母菌等有害微生物利用乳酸和剩余的糖类大量繁殖, 从而加快青贮饲料的有氧变质^{[28, 29]}。本研究中, 各时期ZH1组青贮饲料在开封后192 h内pH相对稳定, 有氧稳定性较好。添加ZH1也能有效提高玉米秸秆和燕麦等青贮饲料的有氧稳定性^[26]。在青贮饲料中添加异型发酵乳酸菌ZH1可以有效抑制好氧细菌和酵母的生长, 是因为青贮过程中产生的乳酸、乙酸和苯甲酸能够通过增加细菌细胞酸性、破坏细胞膜结构、增加渗透压等使好气性细菌受到抑制, 同时, 乙酸和苯甲酸能够使酵母细胞质酸化, 破坏其包膜结构, 另外, 青贮过程中产生的十六烷酸可以通过与线粒体基质中Tim44蛋白结合, 影响其蛋白传递功能, 从而抑制酵母生长^[26]。