引用本文
曾庆飞, 韦鑫, 陈锡, 陈光洁, 马培杰, 吴佳海, 王小利. 多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立. 草业科学, 2017,34(8):1649-1660
Zeng Qing-fei, Wei Xin, Chen Xi, Chen Guang-jie, Ma Pei-jie, Wu Jia-hai, Wang Xiao-li. Optimisation and establishment of a high frequency regeneration system for Lolium multiflorum‘Tetragold’ and L. perenne ‘Four seasons’ . Pratacultural Science,2017,34(8): 1649-1660  
Permissions
Copyright©2017, 《草业科学》编辑部
《草业科学》编辑部
多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立
曾庆飞, 韦鑫, 陈锡, 陈光洁, 马培杰, 吴佳海, 王小利
贵州省农业科学院草业研究所,贵州 贵阳 550006
通信作者：王小利(1977-),男,甘肃镇原人,研究员,博士,主要从事牧草分子生物学研究。E-mail:[email protected]

第一作者:曾庆飞(1969-),男(土家族),贵州德江人,副研究员,博士,主要从事牧草生物技术研究。E-mail:[email protected]

收稿日期: 2017-03-06
基金: 贵州省农业科技攻关项目(黔科合NY[2013]3060号); 贵州省农业科学院博士科研启动基金(2013-06); 黔农科院自主创新科研专项字(2014)010号; 贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合平台人才[2016]5617)
摘要

对在贵州地区广泛种植的多花黑麦草特高( Lolium multiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麦草四季( L. perenne ‘Four seasons’)的成熟种子进行了愈伤组织诱导及植株再生的研究,建立了两个品种的胚性愈伤组织高频诱导与再生体系。结果表明,剥去成熟种子的颖壳,切除1/3胚乳端,将特高接种于CC+7 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA、四季接种于CC+5 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA的培养基中,在明显降低组培污染率的同时,能分别得到65.52%和63.55%的最高愈伤组织诱导率;将两个品种诱导出的愈伤组织转移在MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA+1.25 mg·L-1 CuSO4+1.0 g·L-1 CH的继代培养基上,能促进质量较好的Ⅱ型胚性愈伤组织的形成;根据后续转化试验所选用的植物表达载体pCAMBIA 1300的抗性特点,30~40 mg·L-1的潮霉素是两个品种愈伤组织最佳的筛选剂和临界浓度;特高的胚性愈伤组织接种在MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 TDZ的培养基上,可以产生86.37%的最高分化率,四季的胚性愈伤组织接种在MS+6.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA+5.0 mg·L-1 KT的培养基上,能得到85.40%的最高分化率;生根培养基1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IAA能让两个品种分化出的不定芽形成100%的生根率;以腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1的混合材料作为营养土,能保证组培再生苗达到99%以上的成活率。优化建立的高频组培再生体系为下一步的遗传转化奠定了基础。

关键词: 多花黑麦草特高; 多年生黑麦草四季; 外植体处理; 培养基成分; 激素浓度组合; 抗生素筛选剂; 组培再生体系
中图分类号:S543+.6 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2017)08-1649-12 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0531
Optimisation and establishment of a high frequency regeneration system for Lolium multiflorum‘Tetragold’ and L. perenne ‘Four seasons’
Zeng Qing-fei, Wei Xin, Chen Xi, Chen Guang-jie, Ma Pei-jie, Wu Jia-hai, Wang Xiao-li
Guizhou Institute of Prataculture, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China
Corresponding author: Wang Xiao-li E-mail:[email protected]
Abstract

Using mature seeds of the major ryegrass cultivars in Guizhou Province, annual ryegrass Tetragold and perennial ryegrass Four seasons, as explants, experiments on callus induction and plantlet regeneration were carried out. The results indicated that by peeling off the glume of mature seeds, resecting one-third of the endosperm end, and putting the treated explants of annual ryegrass Tetragold on a medium of CC+7 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA and those of perennial ryegrass Four seasons on a medium of CC+5 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA, the contamination rates of the tissue cultures were significantly decreased, and the highest callus induction rates occurred (65.52% for annual ryegrass Tetragold and 63.55% for perennial ryegrass Four seasons). Transferring the callus induced in the two cultivars on a subculture medium of MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA+1.25 mg·L-1 CuSO4+1.0 g·L-1 CH promoted the formation of type Ⅱ embryogenic callus with better quality. The plant expression vector pCAMBIA 1300 would be used in the subsequent experiment on transformation, and hygromycin was chosen as the best antibiotic selective agent (appropriate critical concentration 30 to 40 mg·L-1). On a medium of MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 TDZ, the highest differentiation rate was 86.37% for embryogenic callus of annual ryegrass Tetragold, and on a medium of MS+6.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA+5.0 mg·L-1 KT, the embryogenic callus of perennial ryegrass Four seasons produced the highest differentiation rate of 85.40%. On a rooting culture medium of 1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IAA, the adventitious buds of both the cultivars attained a rooting rate of 100%; thus, a large number of plantlets were produced by tissue culture. The nutrition soil which was composed of the same proportion of humus, vermiculite, and sandy loam ensured a survival rate of more than 99%. In the present study, the high frequency regeneration systems for annual ryegrass Tetragold and perennial ryegrass Four seasons were optimised and established, which would lay a reliable foundation for their genetic transformation.

Keyword: Lolium multiflorum ‘; Tetragold’; ; L. perenne ‘; Four seasons’; ; explant treatment; medium components; combinations of hormone concentration; antibiotic selective agent; tissue culture regeneration system

黑麦草属(Lolium)禾本科草本植物, 由于其株型外观优美, 并具有生长分蘖快, 茎叶柔嫩光滑, 耐牧性强和绿色期长等优点, 已成为世界温带地区最重要的冷季型禾草[1]。然而, 与其它禾草相比, 黑麦草尚存在对干旱、高热(> 35 ℃)和严寒(< -15 ℃)的耐受力较弱, 对土壤盐碱耐受能力中等, 抗病虫能力较差等不足, 使其进一步的广泛栽培和利用受到限制[2]。因此对黑麦草草种进行品质改良, 培育出抗旱、耐热、耐瘠薄、高产优质的系列黑麦草优良品种, 具有重要的生产价值和现实意义。

常规育种一直是黑麦草新品种选育最主要的方法。但由于黑麦草具有高度的自交不亲和性, 优良基因难以纯合稳定, 采用传统方法进行遗传改良存在诸多局限, 使得黑麦草新品种的选育进展一直很缓慢。采用基因工程手段对已有黑麦草品种进行抗性改良, 缩短育种周期, 加快育种进程, 已成为当前最有效而快捷的途径之一[3]。通过基因转移进行植物遗传改良, 有效的离体再生体系是一个很重要的环节, 成功的基因转化必须依赖于良好的植物遗传转化受体系统的建立。在现有的转基因技术中, 与悬浮细胞和原生质体相比, 愈伤组织由于具有较高的再生频率、良好的稳定性和重复性以及对农杆菌侵染和筛选剂均具有敏感性等特点, 已经被广泛用作遗传转化的主要受体[4]。

国内外针对黑麦草的组织培养与外源基因的遗传转化已经开展了大量的研究, 也已建立起多种植株再生体系和包括农杆菌介导在内的多种遗传转化技术[5], 但在具体的实践过程中对于组培再生体系尚存在一些亟待解决的问题。首先, 种子诱导的愈伤组织污染难于控制。种子存在种壳内外污染物, 特别是壳内细菌和真菌难以彻底杀灭。目前国内外对黑麦草组织培养的研究主要集中在外植体的筛选及培养基的配比上, 而对组织培养中污染率的控制缺少研究[6]。其次, 胚性愈伤组织诱导频率较低。同大多数禾本科牧草一样, 黑麦草组织培养可诱导产生两类形态上明显不同的愈伤组织, 一类是胚性愈伤组织, 再生能力较强; 另一类是非胚性愈伤组织, 植株再生频率极低。在组培实际操作中遇到的一个普遍问题是, 以最为常用的成熟种子(胚)作为外植体, 诱导获得胚性愈伤组织的比例都非常低[7]。如何诱导愈伤组织并对其进行继代和改造, 促进胚性愈伤组织的产生和增殖, 是一个需要深入研究的技术环节。第三, 植株再生频率不稳定。从黑麦草胚性愈伤组织诱导分化形成的再生植株频率高低不同, 可重复性差。因各种原因造成很多试验重复后无法得到相同结果, 即使对同一个品种, 不同的研究者得出的结果也不尽相同, 甚至是矛盾的结论[8, 9]。这说明黑麦草再生体系的方案还不够完善。

本研究选择在贵州地区种植较为普遍的多花黑麦草品种特高(L. multiflorum‘ Tetragold’ )和多年生黑麦草品种四季(L. perenne ‘ Four seasons’ ), 针对黑麦草在建立愈伤组织再生体系培养过程中存在的组培污染、胚性愈伤组织诱导率低、植株再生频率不稳定等主要问题, 开展了外植体处理、组培污染率控制、基本培养基及分化培养基种类、激素种类与浓度配比以及培养条件等内容的研究, 筛选和优化了两个黑麦草品种愈伤组织再生体系的系列条件, 建立起两个品种外源基因植入的高频植株的再生体系, 以期为下一步的遗传转化奠定可靠的物质及技术基础。

1 材料与方法
1.1 材料

试验选用在贵州地区种植较为广泛的一年生黑麦草品种特高和多年生黑麦草品种四季的成熟种子作为外植体材料。特高购于贵阳霖卉园林绿化有限公司, 四季由贵州省草业研究所保存。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的前处理 两个品种的成熟种子均按两种方式分别进行前处理, 一组保留颖壳, 另一组人工剥去颖壳, 使用裸露种子。

在选用植物种子, 特别是有颖壳的种子, 作为外植体诱导愈伤组织的过程中, 组培污染是一个很普遍而且难于控制的问题[6], 这直接影响到后续试验的正常进行。种子消毒的常规方法一般是先将种子作浸泡冲洗处理, 然后用70%~75%酒精消毒1~2 min, 再用0.1%升汞浸泡20~30 min, 或者用10%~20%次氯酸钠浸泡30~60 min。无论选用何种消毒液, 处理时间越短, 消毒越不彻底, 而消毒时间越长, 对种子内部组织的损伤也会越大。为解决这一问题, 本研究将两个品种的黑麦草种子均作了剥去颖壳和保留颖壳两种方式的前处理。先将有壳的完整种子浸泡冲洗后, 同时将完整种子和裸露种子经75%的酒精消毒2 min, 0.1%升汞浸泡20 min后, 一半裸露种子切除1/3胚乳端, 分别接种于诱导培养基中, 30 d后统计3种外植体的污染数。

1.2.2 外植体的消毒预处理 将保留颖壳的成熟种子于4 ℃条件下浸泡过夜, 去掉漂浮种子, 将下层饱满种子用流水冲洗干净后滤干。将浸泡冲洗后的完整种子与剥去颖壳的裸露种子分别用75%的酒精消毒2 min, 无菌水冲洗5次后再用0.1%升汞浸泡20 min, 无菌水冲洗10次。完整种子直接接入诱导培养基上, 裸露种子一部分直接接入诱导培养基, 另一部分用解剖刀先切掉1/3的胚乳端后再接入诱导培养基中。

1.2.3 培养基 MS培养基[10]:添加蔗糖30 g· L-1, 琼脂8 g· L-1。CC培养基[11]:添加蔗糖20 g· L-1, 甘露醇36.43 g· L-1, 维生素C 0.06 g· L-1, 琼脂8 g· L-1。两种培养基均加入2, 4-D(0、1、3、5、7、9 mg· L-1)和6-BA(0、0.5、1.0 mg· L-1), 各自组成18种不同激素浓度的愈伤组织诱导培养基(表1)。

表1 不同激素浓度的愈伤组织诱导培养基 Table 1 The callus inducing media with different concentrations of hormones

继代培养基:① MS+0.5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA; ② MS+0.5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA+1.25 mg· L-1 CuSO4+1.0 g· L-1 CH(酸水解酪蛋白)。

分化培养基:在MS基础培养基中分别加入6-BA(2.0、4.0、6.0 mg· L-1)、NAA(0.05、0.1、0.3、0.5 mg· L-1)、KT(0、2.5、5.0 mg· L-1)和TDZ(0、0.1、0.3 mg· L-1), 组合成12种不同激素浓度配比的分化培养基(表2)。

表2 不同激素浓度配比的分化培养基 Table 2 The differentiation media with different concentration ratio of hormones

壮苗培养基:无激素MS培养基。

生根培养基:1/2MS+0.5 mg· L-1 NAA+0.5 mg· L-1 IAA。

1.2.4 愈伤组织的诱导及继代培养 将经过消毒处理的两个黑麦草品种的完整种子以及去壳种子中的切除1/3胚乳与全裸种子分别接种于不同的诱导培养基组合, 每个150 mL三角瓶的50 mL培养基上接种20~25粒种子, 每个处理3次重复, 置于(26± 1) ℃黑暗培养条件下诱导愈伤组织。7 d后开始统计种子的出愈率, 每隔5 d记录一次, 直至接种后第40天。

40 d后将各处理诱导出的愈伤组织一分为二, 分别转移至两种继代培养基上培养, 每次继代培养时间25~30 d, 继代培养条件与诱导培养相同。

1.2.5 抗生素临界浓度的确定 由于后续遗传转化所选用的载体是经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造后的pCAMBIA 1300植物表达载体, 该载体具有潮霉素(hygromycin, Hyg)和卡那霉素(kanamycin, Kan)的抗性, 因此所选用的抗生素筛选剂为Hyg和Kan。

测定方法:将继代培养形成的同一批次相同形态的胚性愈伤组织放入含不同浓度筛选剂的MS培养基上, 并以在不含筛选剂培养基上的愈伤组织作对照。记录每一处理愈伤组织的初始质量(W0), 培养40 d后再记录每一处理愈伤组织的质量(Wt), 然后分别计算愈伤组织质量增长率和愈伤组织相对质量增长率(对应浓度抗生素对愈伤组织的抑制效果)。

1.2.6 愈伤组织分化与植株再生 将继代培养获得的胚性愈伤组织转入12组分化培养基中, 每个处理3次重复。在(25± 1) ℃、光照时间12 h· d-1、光强2 000 lx的培养室中进行分化培养。连续观察分化情况, 直至分化长出无根不定芽, 统计分化率。短于1 cm的不定芽首先置于壮苗培养基上壮苗, 7 d后转至生根培养基中。当幼根在生根培养基中长至2 cm左右时, 揭开瓶盖炼苗2~3 d后, 移栽至盛有营养土(腐殖土∶ 蛭石∶ 砂壤土=1∶ 1∶ 1)的花钵中。

1.3 数据处理

试验过程中对外植体污染率、愈伤组织诱导率、愈伤分化率、生根率和植株再生率进行了严格统计。每个处理3次重复, 计算总平均数; 每个重复包含20~25个外植体、愈伤组织或分化苗。

统计项目分别按下列公式计算:

外植体污染率=(外植体受污染数/接种外植体数)× 100%;

愈伤组织诱导率=(诱导的愈伤组织总数/接种外植体数)× 100%;

愈伤组织质量增长率(r)=(Wt-W0)× 100%;

愈伤组织相对质量增长率(R)=r/r0× 100%(r0为对照愈伤组织的质量增长率);

愈伤组织分化率=(有芽形成的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数)× 100%;

生根率=(有根形成的不定芽块数/接种的不定芽总数)× 100%;

植株再生率=(分化成植株的愈伤组织块数/转入分化培养基的愈伤组织块数)× 100%。

对各组培处理的诱导率、分化率等数据, 采用Excel和SPSS数据处理软件分别进行统计分析和显著性测验。

2 结果与分析
2.1 不同外植体处理方式对愈伤组织诱导的影响

2.1.1 不同前处理方式对外植体污染率的影响 统计结果(表3)表明, 无论是多花黑麦草特高, 还是多年生黑麦草四季的种子, 直接用完整种子作为外植体, 在诱导愈伤组织过程中的污染率均在42%以上, 而提前将种子的颖壳剥除后, 采用相同的消毒处理方法, 切割与未切割种子的污染率均降低到了10%以下, 去壳与保留颖壳相比, 差异极显著(P< 0.01)。说明使用剥除颖壳的黑麦草种子作为外植体, 能明显降低组培过程中的污染率。

表3 种子不同前处理方式对组培污染率的影响 Table 3 Effect of different treatments of seeds on contamination rate during tissue culture

2.1.2 不同种子处理方式对愈伤组织诱导频率的影响 将3种经不同前处理的种子分别接种于不同激素浓度组合的MS和CC培养基上, 15 d后即有直径2 mm左右的淡黄色愈伤颗粒出现, 40 d后愈伤组织直径达4~5 mm(表4)。可以看出, 特高和四季两个品种裸露种子和切除1/3胚乳种子均比完整种子的出愈数要高, 诱导率达到显著差异(P< 0.05)和极显著(P< 0.01), 这可能是完整种子污染率较高的原因。而在裸露种子中, 切除胚乳端的与未经切割的两者之间的种子出愈率呈现出极显著差异, 说明种子经适当切割后, 能明显提高愈伤组织的诱导频率。

表4 不同前处理方式对愈伤种子诱导率的影响 Table 4 Effect of different treatments of seeds on callus ratio
2.2 培养基、激素浓度对愈伤组织诱导频率的影响

2.2.1 不同基本培养基的愈伤组织诱导率 两个品种在两种培养基中总的愈伤组织诱导数量及诱导频率的统计结果(表5)显示, 一年生黑麦草特高与多年生黑麦草四季在MS和CC培养基中都能正常诱导出愈伤组织, 但CC培养基的诱导率明显高于MS。特高在两种培养基间呈显著差异(P< 0.05), 而四季则呈极显著差异(P< 0.01)。表明CC培养基更适合于特高和四季两个黑麦草品种愈伤组织的诱导。

表5 不同培养基对愈伤组织诱导率的影响 Table 5 Effect of different media on callus induction of ryegrass

2.2.2 2, 4-D与6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响 将特高和四季经过处理的种子分别接种在含有不同2, 4-D与6-BA浓度的MS及CC培养基中, 根据40 d后对各培养基中种子出愈数量的统计和差异显著性测验, 分别得到了2, 4-D与6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响关系(表6)。

表6 2, 4-D和6-BA浓度对黑麦草愈伤种子诱导率的影响 Table 6 Effect of concentration of 2, 4-D and 6-BA on callus induction of ryegrass

统计结果表明, 无2, 4-D培养基中的两个黑麦草品种均不能诱导形成愈伤组织。在1~7 mg· L-1的范围内, 随着2, 4-D浓度的增加, 出愈率基本呈逐渐增加的趋势, 当2, 4-D浓度升至9 mg· L-1时, 愈伤组织诱导率反而有所降低。多花黑麦草特高在7 mg· L-1的2, 4-D浓度时, 愈伤组织诱导率达到最大值(46.58%), 与5 mg· L-1时的诱导率呈显著差异(P< 0.05), 与1和3 mg· L-1时的诱导率达到极显著差异(P< 0.01), 但与9 mg· L-1时的诱导率差异不显著(P> 0.05)。多年生黑麦草四季在5 mg· L-1的2, 4-D浓度时, 愈伤组织诱导率最高(44.23%), 但与7 mg· L-1时的诱导率差异不显著, 而与1、3和9 mg· L-1时的出愈率差异均达到极显著水平。

6-BA浓度与愈伤组织诱导关系的统计结果表明(表6), 在3个浓度梯度的设置中, 无6-BA仅含有2, 4-D的培养基也能正常诱导出愈伤组织, 但两个品种的黑麦草都是在6-BA浓度为0.5 mg· L-1的培养基中愈伤组织诱导率最高, 而且6-BA培养基都与无6-BA培养基的诱导率呈极显著差异(P< 0.01)。当培养基中6-BA的浓度达到1.0 mg· L-1时, 出愈率反而有所降低。其中特高1.0与0.5 mg· L-1时的诱导率呈极显著差异, 四季1.0与0.5 mg· L-1的诱导率呈显著差异(P< 0.05)。说明6-BA的浓度只能在一个较小范围内有助于愈伤组织的诱导, 超过一定数量后反而会产生抑制作用。

2.2.3 不同激素浓度组合对愈伤组织诱导的影响 在设计的18种不同激素浓度组合的培养基中, 愈伤组织的诱导率出现不同程度的差异(表7)。对于多花黑麦草特高, 激素组合7 mg· L-12, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA 的愈伤组织诱导率最高, 比次之的9 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA组合的诱导率高1.55百分点, 与5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA组合的诱导率之间差异显著(P< 0.05); 对于多年生黑麦草四季, 激素组合5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA具有最大出愈率, 比稍低的7 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA组合的出愈率高2.07百分点, 与9 mg· L-12, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA 组合的诱导率差异显著(P< 0.05)。同时观察还发现, 当6-BA的浓度偏高时, 愈伤组织的生长势还会变差。

表7 不同激素浓度组合诱导率差异显著性测验 Table 7 Significant difference at 0.01 and 0.05 level in callus ratio of different concentrations and combinations of hormones

综合种子处理方式、培养基种类和激素浓度组合对愈伤组织诱导频率及生长质量的影响结果, 筛选出两个黑麦草品种的最佳愈伤组织诱导条件分别为:多花黑麦草特高, 以剥去颖壳后切除1/3胚乳端的种子作为外植体, 接入CC+7 mg· L-12, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA的诱导培养基; 多年生黑麦草四季, 以剥去颖壳后切除1/3胚乳端的种子作为外植体, 以CC+5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA作为诱导培养基。

2.3 培养基成分对愈伤组织继代培养的影响

无论是以MS还是CC作为基本培养基, 两个品种的黑麦草所诱导出的愈伤组织都表现出不同的形态特征。根据Armstrong[12]的标准可以将它们分为3种类型:Ⅰ 型, 质地疏松, 生长较快, 部分愈伤组织表面呈白色片层状, 不易长期继代; Ⅱ 型, 结构致密, 生长适中, 呈颗粒状, 长期继代仍有胚性; Ⅲ 型, 结构粘软, 呈白色透明或半透明水浸状, 生长缓慢, 容易继代培养, 但几乎丧失分化能力。本研究在诱导过程中观察发现, 在2, 4-D浓度为3~7 mg· L-1、6-BA浓度为0和0.5 mg· L-1时, 诱导出的多为Ⅱ 型愈伤组织; 当2, 4-D浓度为9 mg· L-1、6-BA浓度为1.0 mg· L-1时, 则Ⅲ 型愈伤组织所占比例较大。研究将诱导出的两个品种的Ⅱ 型愈伤组织挑选出来, 一分为二, 分别接种于所设计的两种继代培养基上, 以比较两种培养基的继代培养效果。

每次继代培养时间25 d, 次继代培养后统计发现, 两种培养基上的愈伤组织在颗粒大小和质量上都有不同程度的增加, 并形成了不同比例的结构紧密、淡黄色或乳白色、表面有乳状突起的Ⅱ 型胚性愈伤组织。其中在1号继代培养基(MS+0.5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA)上的Ⅱ 型胚性愈伤组织不到50%, 乳白色颗粒较多(图1A); 2号继代培养基(MS+0.5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA+1.25 mg· L-1CuSO4+1.0 g· L-1 CH)上的Ⅱ 型胚性愈伤组织占60%以上, 且色泽鲜艳, 淡黄色颗粒较多(图1B)。说明在继代培养过程中, 适当浓度的硫酸铜和酸水解酪蛋白有助于胚性愈伤组织的形成。

图1 分别在1号培养基(A)和2号培养基(B)上继代培养的黑麦草愈伤组织Fig. 1 The subcultured callus of ryegrass on medium No. 1(A) and on medium No. 2(B) whose compositions have been provided in “ Materials and methods”

2.4 抗生素临界浓度的确定

利用未转入外源基因的特高和四季同一批次的胚性愈伤组织进行抗生素不同浓度的抑制效果测定。统计结果表明(表8), Hyg与Kan对两个品种愈伤组织的生长抑制作用有所不同。Hyg的抑制作用明显较大, 在低浓度条件下即可使愈伤组织的质量增长明显受阻; 而Kan在高达1 000 mg· L-1的浓度时, 愈伤组织依然有20%以上的增长水平。因此, 在本研究的后续转化试验中, 适合选用Hyg作为筛选剂来进行转化子的筛选, 而且筛选条件以40 mg· L-1的浓度培养40 d左右或者30 mg· L-1的浓度培养60 d左右为宜。

表8 潮霉素与卡那霉素对黑麦草愈伤组织生长的抑制作用 Table 8 Effect of hygromycin and kanamycin on callus growth
2.5 不同激素和激素组合对愈伤组织分化不定芽的影响

选择多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季两个品种在抗性培养基上生长良好的淡黄色、质地致密、呈颗粒状堆积的胚性愈伤组织转移到12种不同激素浓度与激素配比的分化培养基中, 每一培养基接种20颗愈伤组织, 每种培养基3次重复, 在光暗交替条件下培养。5 d后即有绿色芽点分化, 20 d后逐渐形成不定芽(图2)。30 d后统计两个品种愈伤组织的分化率(表9), 可以看出, 多花黑麦草特高在10号培养基(MS+2.0 mg· L-1 6-BA+0.5 mg· L-1 NAA+0.1 mg· L-1 TDZ)中的分化率最高, 达86.37%, 与其余9种培养基的分化率均呈现出显著(P< 0.05)或极显著(P< 0.01)差异; 而多年生黑麦草四季则是在9号培养基(MS+6.0 mg· L-1 6-BA+0.3 mg· L-1 NAA+5.0 mg· L-1 KT)中具有最大的分化率(85.40%), 也同其余9种培养基的分化率达到了显著或极显著差异水平。说明6-BA与NAA对黑麦草的愈伤分化都是至关重要的, 而且不同品种对两者浓度的最佳组合表现出不同的要求; 同时, 单独添加TDZ与KT能分别提高特高和四季愈伤组织的分化率。

图2 多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季胚性愈伤组织分化形成的不定芽Fig. 2 The adventitious buds of Tetragold annual ryegrass and Four seasons perennial ryegrass differentiating from embryogenic callus

表9 不同培养基中愈伤组织的分化率 Table 9 Differentiation rates of embryogenic callus on different media
2.6 再生植株的获得

在分化培养30 d后统计分化率时, 特高和四季两个品种均形成有大小不同的不定芽。将大于2 cm的不定芽直接转入生根培养基中, 短于2 cm的不定芽先植入壮苗培养基上壮苗, 7 d后再转入生根培养基。在生根培养基中的不定芽10 d左右即开始生根, 30 d后所有幼苗都长出了2~5 cm的幼根(图3), 生根率100%, 说明所选用的生根培养基(1/2MS+0.5 mg· L-1 NAA +0.5 mg· L-1 IAA)能有效促进不定芽幼根的形成。

图3 多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季不定芽形成的幼根Fig. 3 Rootlets of Tetragold annual ryegrass and Four seasons perennial ryegrass forming from adventitious buds

长出幼根的不定芽在组培瓶内生长很快。当再生苗株高长至6~8 cm时, 在15~25 ℃室温条件下揭开瓶盖炼苗2~3 d后, 从瓶内小心取出, 清水洗净琼脂, 移栽至盛有营养土(腐殖土∶ 蛭石∶ 砂壤土=1∶ 1∶ 1)的花钵中, 浇足定根水。7 d后统计, 再生苗移栽成活率为99%。其中获得多花黑麦草特高的盆栽再生苗236株, 平均植株再生率63.16%; 获得多年生黑麦草四季的盆栽再生苗184株, 平均植株再生率59.37%。

3 讨论与结论

自20世纪70年代开始, 随着基因工程技术的兴起与蓬勃发展, 植物高频再生体系的研究工作被广泛开展, 并相继建立起了原生质体再生系统、愈伤组织再生系统、悬浮和生殖细胞再生系统等多种遗传转化受体系统。对于禾本科牧草这类单子叶植物来说, 由器官直接分化形成再生植株的难度较大, 细胞悬浮系的建立和原生质体的再生也十分困难, 选用愈伤组织再生系统, 则具有外植体材料来源广泛、愈伤组织扩繁量大和再生能力较为稳定等优点, 被认为是一种较为理想的遗传转化受体系统[13]。在禾本科牧草黑麦草愈伤组织的诱导中, 成熟胚、胚轴、胚根和幼穗都可以用来作为外植体, 但由于成熟种子取材方便且不受季节影响, 已成为被研究者们普遍选用的外植体[14]。黑麦草和高羊茅(Festuca arundinacea)这一类带有颖壳的牧草种子, 其颖壳内外不可避免的会有大量微生物的附集, 在作为外植体的愈伤诱导时不容易彻底消毒, 而消毒液较长时间的浸泡又会损伤种子内部组织, 进而影响愈伤组织的诱导效果, 因而组培污染成了一个较难控制的普遍现象。本研究试着将一部分黑麦草的颖壳提前剥除成为裸露种子, 与保留颖壳的完全种子采用相同的消毒处理方法, 分别接种于诱导培养基上。结果证明, 无论切除1/3胚乳与否的裸露种子, 其外植体污染率都明显小于完整种子, 这为后续试验提供了一个良好的先决保障。去除颖壳虽然需要增加工作量, 但它可以提前准备, 无需人工劳动的集中投入, 因此是控制组培污染的一种有效手段。

黑麦草成熟种子虽然是愈伤诱导的一种常用外植体, 但完整种子的愈伤组织诱导率普遍偏低[15]。本研究通过将一部分裸露种子在无菌条件下切掉1/3的胚乳端, 结果与非切割裸露种子相比, 大大提高了愈伤组织的诱导率。种子切割另有切留胚端半粒种子、竖划种子等方法的报道[16], 但无论采取何种切割方法, 愈伤诱导率都能得到显著增加。可能的原因是, 切割打开了种皮的包被, 增加了种子对激素的吸收, 同时胚芽受损后在抑制种子萌发的同时能刺激愈伤组织的形成。只是带壳切种依然容易产生组培污染的问题[17], 本研究试用裸种切割的方法, 既有效控制了污染现象, 又明显提高了愈伤组织的诱导率。所以外植体的前处理方式对于愈伤组织的诱导也是一个不可忽视的重要因素。

外植体在得到适当的前处理以后, 培养基成分就成了愈伤组织诱导的关键要素。在众多培养基类型中本研究选用了MS与CC两种基本培养基。试验结果显示, 一年生黑麦草特高与多年生黑麦草四季在CC培养基上的愈伤组织诱导率都明显高于MS。原因可能是, CC培养基中添加的甘露醇能维持培养基中的高渗透压, 连同添加的维生素C, 在促进愈伤组织形成的同时, 能使愈伤生长更为致密。在一定的基本培养基中, 激素组合与激素浓度是最重要的愈伤组织诱导因子。众多的研究提出, 作为生长素类的2, 4-D在愈伤组织诱导中是必不可少的一种外源激素[18]。本研究设置了0~9 mg· L-1共6个水平的2, 4-D浓度, 结果表明, 无2, 4-D的培养基不能诱导愈伤组织, 而在1~9 mg· L-1的范围内, 总体趋势是, 愈伤组织诱导率会随着2, 4-D浓度的增加而增加, 但特高的最佳诱导浓度是7 mg· L-1, 四季的最佳诱导浓度则是5 mg· L-1, 说明2, 4-D的浓度也并非越高越好。6-BA在愈伤组织诱导中的作用有着不同的报道结果。如, 多年生黑麦草爱神特在6-BA浓度为0时, 愈伤诱导率反而最高[19]; 在用大穗黑麦草(Lolium grandispicum)成熟种子诱导愈伤时发现, 在0~1.0 mg· L-1的范围内, 6-BA浓度越大, 愈伤诱导率越高[20]; 以紫花苜蓿(Medicago sativa)的下胚轴为材料进行试验, 参试4个品种的6-BA浓度在0.5~2.0 mg· L-1的范围内浓度越大, 愈伤诱导效果越好[21]。说明作为细胞分裂素类的6-BA, 在愈伤组织诱导中的重要性以及最佳浓度范围会因植物种类及基因型的不同而不同。魏树强等[9]以多年生黑麦草‘ 高帽2号’ (L. perenne ‘ Top Hat 2’ )的颖果为外植体, 通过设计二因素四水平的正交试验, 获得了MS+5 mg· L-1 2, 4-D+0.03 mg· L-1 6-BA的优化诱导培养基, 愈伤组织诱导率达到68.7%, 而本研究针对多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季所获得的优化诱导培养基分别为CC+7 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA与CC+5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA, 激素种类组合与之相同, 但基本培养基种类与激素浓度组合以及所得到的最高愈伤组织诱导率却不完全相同。这进一步证实了不同基因型的黑麦草品种对应着不同的最佳诱导培养基成分, 且最高愈伤组织诱导率也存在一定差异。

在愈伤组织的继代培养过程中, 本研究只选用了激素浓度较低的组合MS+0.5 mg· L-1 2, 4-D+0.5 mg· L-1 6-BA 作为继代培养基, 但另外在该组合培养基中添加了1.25 mg· L-1的硫酸铜以及1.0 g· L-1的酸水解酪蛋白(CH)作为对比。关于添加物对愈伤组织继代培养的影响关系还鲜有报道。本研究结果证明, 培养基中添加适当浓度的CuSO4和CH后, 不但能增加胚性愈伤组织形成的数量, 还能提高愈伤组织的质量, CuSO4和CH是继代培养基中的有益成分。

通过继代培养形成成熟的胚性愈伤组织, 目的是为了获得外源基因的受体材料而进行遗传转化。转化子的筛选首先需要通过抗生素的压力选择, 因此针对转化材料进行相应抗生素临界浓度的预先测定, 是保证后续转化试验成功进行的环节之一。本研究后面将要进行的遗传转化试验所选用的载体是经过贵州省草业研究所分子生物学实验室改造过的pCAMBIA 1300植物表达载体, 该载体具有Hyg和Kan抗性, 因此本研究只选择它们作为抗生素筛选剂。通过对愈伤组织的生长抑制作用测定发现, 本研究中30~40 mg· L-1的Hyg是最佳的筛选剂和临界浓度, 这一结果与陈智勇等[22]关于Hyg和Kan对多年生黑麦草愈伤组织抑制作用的研究结论是一致的。

分化培养基中激素组合与浓度配比是影响愈伤组织分化率的关键因素[23]。在参考大量相关文献的基础上, 本研究设计了12种激素浓度梯度的分化培养基组合。从培养基组合之间分化率的差异可以看出, 无6-BA的培养基其分化率相对较低, 6-BA与NAA的浓度配比对分化率的高低起着主要作用, 而且不同的品种对这一浓度配比有着不同的要求。另外, 本研究中多花黑麦草特高的最适培养基中含有细胞分裂素活性很强的TDZ, KT则能促进品种四季愈伤组织的分化, 而将TDZ与KT同时加入培养基后促分化效率反而有所降低。TDZ在一些豆科植物愈伤组织的分化中应用较多, 并能产生良好的促分化效果[24], 但在禾本科牧草中的应用报道却很少。

在生根诱导过程中, 本研究选用的是只含有0.5 mg· L-1低浓度NAA和IAA的1/2MS培养基, 并获得了良好的生根效果。事实上, 黑麦草组培苗在没有外源激素供给的情况下也能生根, 只是生成的根系质量较差[25]。加入适量的外源激素, 能诱导形成粗壮的根系, 并促进植株的生长发育。将组培苗移栽至花钵中时, 本研究使用的营养土除含有腐殖土和蛭石外, 还添加了1/3的砂壤土。这不仅没有影响移栽成活率, 还能保持移栽后的再生苗具有较快的生长势。

(责任编辑 王芳)

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Healy M G, Ryan P C, Fenton O, Peyton D P, Wall D P, Morrison L. Bioaccumulation of metals in ryegrass ( Lolium perenne L. ) following the application of lime stabilised, thermally dried and anaerobically digested sewage sludge. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016, 130: 303-309. [本文引用:1]
[2] 谢宏伟, 徐庆国, 李阳. 黑麦草高温胁迫抗性与抗旱性遗传育种研究进展. 作物研究, 2011, 25(1): 89-94.
Xie H W, Xu Q G, Li Y. Research progress of genetic breeding of high temperature resistance stress and drought resistance of Lolium perenne. Crop Research, 2011, 25(1): 89-94. (in Chinese) [本文引用:1]
[3] 马欣荣, 刘华玲, 谈心. 植物生物技术在黑麦草遗传改良中的应用. 应用与环境生物学报, 2007, 13(6): 881-887.
Ma X R, Liu H L, Tan X. Application of plant biotechnology in ryegrass genetic improvement. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2007, 13(6): 881-887. (in Chinese) [本文引用:1]
[4] 金忠民, 沙伟, 张艳馥, 孙微, 刘文靖. 羊茅种子愈伤组织诱导及再生体系的建立. 草业科学, 2010, 27(10): 60-63.
Jin Z M, Sha W, Zhang Y F, Sun W, Liu W J. Establishment of regeneration system and callus inducing of Festuca ovina seeds. Pratacultural Science, 2010, 27(10): 60-63. (in Chinese) [本文引用:1]
[5] Altpeter F. Perennial ryegrass ( Lolium perenne L. ). Methods in Molecular Biology, 2006, 344: 55-64. [本文引用:1]
[6] 刘占彬, 袁庆华. 多花黑麦草种子外植体组织培养灭菌方法研究. 草地学报, 2009, 17(4): 474-479.
Liu Z B, Yuan Q H. Study on the sterilization methods in tissue culture of Italian ryegrass seed explants. Acta Agrestia Sinica, 2009, 17(4): 474-479. (in Chinese) [本文引用:2]
[7] 杜雪玲, 张振霞, 刘萍, 杨中艺, 符义坤. 2, 4-D和6-BA对多年生黑麦草愈伤组织诱导影响的研究. 草原与草坪, 2005(3): 49-51.
Du X L, Zhang Z X, Liu P, Yang Z Y, Fu Y K. The effect of 2, 4-D and 6-BA on callus induction of perennial ryegrass. Grassland and Turf, 2005(3): 49-51. (in Chinese) [本文引用:1]
[8] 文沛玲, 瞿杨, 叶光明, 杨秉健, 杜小姣. 不同浓度6-BA对黑麦草种子出愈率的影响. 草原与草坪, 2014, 34(3): 20-23, 30.
Weng P L, Qu Y, Ye G M, Yang B J, Du X J. Effects of 6-BA with different concentrations on callus induction rate of ryegrass seeds. Grassland and Turf, 2014, 34(3): 20-23, 30. (in Chinese) [本文引用:1]
[9] 魏树强, 钱永强, 刘俊祥, 孙振元. 多年生黑麦草再生体系的建立. 广西植物, 2015, 35(5): 709-714.
Wei S Q, Qian Y Q, Liu J X, Sun Z Y. Establishment of tissue regeneration system of Lolium perenne. Guihaia, 2015, 35(5): 709-714. (in Chinese) [本文引用:2]
[10] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Journal of Plant Physiology, 1962, 15: 473-479. [本文引用:1]
[11] Portrykus I, Harms C T, Lorz H. Callus formation from cell culture protoplasts of corn. Theoretical and Applied Genetics, 1979, 54: 209-214. [本文引用:1]
[12] Armstrong C L. Establishment and maintenance of firable, embryo genic maize callus and the involvement of L-proline. Planta, 1985, 164: 207-214. [本文引用:1]
[13] 陈季琴, 韩烈保, 杨纯奇, 李雪. 不同外植体对多年生黑麦草愈伤组织诱导的影响. 草原与草坪, 2005(4): 42-46.
Chen J Q, Han L B, Yang C Q, Li X. Effect of different explants on callus induction of perennial ryegrass. Grassland and Turf, 2005(4): 42-46. (in Chinese) [本文引用:1]
[14] 臧文静, 陈莹, 李青, 苟孝琴, 武炳超, 杨盛婷, 张锐, 张新全, 黄琳凯. 杂交狼尾草不同外植体愈伤组织诱导. 草业科学, 2015, 32(9): 1451-1456.
Zang W J, Chen Y, Li Q, Gou X Q, Wu B C, Yang S T, Zhang R, Zhang X Q, Huang L K. Tissue culture differentiation and callus induction of different explant from Pennisetum americanum×P. purureum. Pratacultural Science, 2015, 32(9): 1451-1456. (in Chinese) [本文引用:1]
[15] Akashi R, Hashimoto A, Adaehi T. Plant regeneration from seed-drived embryogenic callus and cell suspension cultures of bahiagass. Plant Science, 1993, 90: 73-89. [本文引用:1]
[16] 杨茹, 袁庆华, 曹致中, 王锁民. 2, 4-D和BA对黑麦草不同外植体愈伤组织诱导与分化的影响. 中国草地学报, 2008, 30(4): 34-39.
Yang R, Yuan Q H, Cao Z Z, Wang S M. Effect of different explants on callus induction and differentiation of perennial ryegrass. Chinese Journal of Grassland , 2008, 30(4): 34-39. (in Chinese) [本文引用:1]
[17] 蔡能, 易自力, 陈智勇, 刘清波, 蒋建雄. 多年生黑麦草高频再生体系的建立及优化. 中国草地学报, 2007, 29(4): 45-49.
Cai N, Yi Z L, Chen Z Y, Liu Q B, Jiang J X. Establishment and modification of high frequency regeneration system of perennial ryegrass ( Lolium perenne L. ). Chinese Journal of Grassland , 2007, 29(4): 45-49. (in Chinese) [本文引用:1]
[18] 钏秀娟, 陈彩虹, 罗丽娟. 热研5号柱花草高频、优质愈伤组织的诱导. 草业科学, 2015, 32(1): 78-84.
Chuan X J, Chen C H, Luo L J. Callus induction of Stylosanthes guianensis cv. Reyan No. 5. Pratacultural Science, 2015, 32(1): 78-84. (in Chinese) [本文引用:1]
[19] 段碧华, 韩宝平, 高遐虹, 孙月梅. 两种冷季型草坪草愈伤组织诱导研究初报. 北京农学院学报, 2005, 20(1): 65-67.
Duan B H, Han B P, Gao X H, Sun Y M. Studies on callus induction of two cool-season turfgrass cultivars. Journal of Beijing Agricultural College, 2005, 20(1): 65-67. (in Chinese) [本文引用:1]
[20] 余泽高, 黄喜梅. 大穗黑麦草成熟种子愈伤组织诱导及分化的研究. 河南农业科学, 2004(12): 7-10.
Yu Z G, Huang X M. Studies on callus induction and differentiation of mature seed of Lolium grand ispicum. Henan Agricultural Sciences, 2004(12): 7-10. (in Chinese) [本文引用:1]
[21] 马晖玲, 卢欣石, 曹致中, 葛军. 紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究. 草业学报, 2004, 13(6): 99-105.
Ma H L, Lu X S, Cao Z Z, Ge J. Study on plant regeneration in diverse cultivars of Medicago sativa. Acta Prataculturae Sinica, 2004, 13(6): 99-105. (in Chinese) [本文引用:1]
[22] 陈智勇, 易自力, 蒋建雄, 覃静萍, 刘清波, 蔡能, 唐小艳, 孙鏖. 多年生黑麦草愈伤组织遗传转化受体系统的建立. 草原与草坪, 2007(3): 28-32.
Chen Z Y, Yi Z L, Jiang J X, Qin J P, Liu Q B, Cai N, Tang X Y, Sun A. Establishment of the transformation receptor system for Lolium perenne. Grassland and Turf, 2007(3): 28-32. (in Chinese) [本文引用:1]
[23] 阳宴清, 王咏, 朱美兰, 卢运海. 芦竹愈伤组织诱导及再生体系的建立. 草业科学, 2016, 33(7): 1332-1341.
Yang Y Q, Wang Y, Zhu M L, Lu Y H. A study on callus induction and plant regeneration in giant reed. Pratacultural Science, 2016, 33(7): 1332-1341. (in Chinese) [本文引用:1]
[24] Bahgat S, Shabban O A, El-Shihy O, Lightfoot D A, El-Shemy H A. Establishment of the regeneration system for Vicia faba L. Current Issues in Molecular Biology, 2009, 11(1): 47-54. [本文引用:1]
[25] 郑若男, 阮以勒, 郑双双, 杨志红. 原种黑麦草组培再生体系建立初探. 安徽农业科学, 2013, 41(15): 6608-6610.
Zheng R N, Ruan Y L, Zheng S S, Yang Z H. Establishment of tissue regeneration system of Lolium multiflorum L. Anhui Agricultural Sciences, 2013, 41(15): 6608-6610. (in Chinese) [本文引用:1]