白花草木樨的5份种质来自我国国家牧草种质资源库(北京)(表1)。其中, ZXY06P-1732和 ZXY05P-983来自俄罗斯, HB2009-153来自中国信阳, 中畜-1226和ZXY07P-3150来源地不详。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试材料及来源信息 Table 1 Origin information of the tested Melilotus germplasm 编号 No. 种质库编号 Accession No. 来源地 Origin 经度 Latitude 纬度 Longitude Pop1 ZXY06P-1732 俄罗斯Russia 62° 00'00″ E 9° 00'00″ N Pop2 中畜-1226 — — — Pop3 ZXY07P-3150 — — — Pop4 ZXY05P-983 俄罗斯Russia — — Pop5 HB2009-153 中国信阳Xinyang, China 114° 04'09″ E 32° 06'17″ N 注:“ — ” 表示信息不详。 Note: “ — ” means the information is unknown.

表1 供试材料及来源信息 Table 1 Origin information of the tested Melilotus germplasm

1.2.1 EST-SSR引物的开发与设计 由诺和公司完成白花草木樨转录组测序数据已提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra), 采用MISA(1.0版)对Unigene进行SSR检测, 识别标准为:包含1、2、3、4、5、6个碱基重复单元的EST-SSR分子标记的最小重复数分别为10、6、5、5、5、5。通过两个引物之间不发生互补, 特别是在引物3'端, 即使无法避免, 其3'端互补碱基也应不大于两个碱基的筛选原则, 利用软件Primer3^{[23, 24]}(默认参数)设计EST-SSR引物。

1.2.2 DNA的提取 每种材料取18个单株的新鲜叶片混合, 用SDS法^[25]提取叶片的总DNA, 将提取出来的DNA用琼脂糖凝胶电泳检测其质量, 对合格样品加ddH₂O稀释到50 ng· μ L^-1, 置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 引物筛选、PCR扩增及电泳 转录组测序获得的18 182对EST-SSR引物, 根据引物的碱基重复类型(除一碱基之外)、片段长度(150~200 bp)、退火温度(55~60 ℃)等条件筛选得到550对EST-SSR引物用于本试验。PCR反应体系总体积为10 μ L, 含1.0 μ L模板DNA, 4 μ mol· L^-1正反引物各1 μ L, 0.1 μ LDNA聚合酶, 4.9 μ L 2 × Reaction Mix, 2 μ L ddH₂O。初步筛选反应程序:94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 引物最适退火温度退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环; 72 ℃延伸7 min; 4 ℃保存。扩增产物用6.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 银染。本试验使用DL500DNA Marker。

通过人工读带, 根据扩增条带在相对迁移位置的有无, 记数为“ 1” 或“ 0” , 建立原始数据矩阵, 统计每个EST-SSR位点的等位基因数, 计算引物的多态信息含量PIC^[26]以及期望杂合度(H_e)。

PIC=1-∑ Pi2.

式中:P_i指第i个等位基因出现的频率。

H_e=1- ∑i=1nPi2.

用Popgen32软件统计分析Nei’ s多样性指数和Shannon信息指数。

通过SSR识别工具软件MISA(1.0版)对得到的功能基因进行位点识别后, 从15 260个功能基因中共识别出了19 263个潜在的EST-SSR位点。EST-SSR引物的设计由Primer3软件完成, 设计得到18 182对EST-SSR引物。其中单碱基的有11 398对, 二碱基的有2 986对, 三碱基的有3 461对, 四碱基的有299对, 五碱基的有29对, 六碱基的有9对。进一步根据碱基重复类型、预期片段大小和退火温度等条件来挑选, 共有符合要求的550对引物EST-SSR用于进一步筛选, 其中二碱基的有136对, 三碱基的有317对, 四碱基的有84对, 五碱基的有12对, 六碱基的有1对(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 EST-SSR引物的来源及碱基重复类型 Table 2 The origin and variation type of the EST-SSR primers 核心单元 EST-SSR motif 转录组测序获得的 EST-SSR引物 EST-SSR from primers designed RNA-seq 本研究选用的 EST-SSR引物 EST-SSR primers used for the study 单碱基Nucleotide 11 398 0 二碱基Dinucleotide 2 986 136 三碱基Trinucleotide 3 461 317 四碱基Tetranucleotide 299 84 五碱基Pentanucleotide 29 12 六碱基Hexanucleotide 9 1 合计Total 18 182 550

表2 EST-SSR引物的来源及碱基重复类型 Table 2 The origin and variation type of the EST-SSR primers

利用白花草木樨材料对550对EST-SSR引物进行筛选验证, 结果表明, 共有351对引物能够扩增出条带, 而剩余的199对引物在多个退火温度下都没有检测出PCR扩增产物。在能够成功扩增出条带的草木樨EST-SSR引物中, 共有290对引物获得条带清晰、大小合适的扩增产物, 而剩余的61对引物扩增出的PCR产物条带大小都大于或小于引物的预期片段大小。经过计算各个引物的多态性指标, 在能够扩增出引物预期片段大小的草木樨EST-SSR引物中, 206对引物表现出多态性(图1), 而剩余的84对引物未表现出多态性(表3)。206对草木樨EST-SSR引物共检测出679个等位基因, 变幅为2~6个, 平均每对引物检测出2.888个基因位点, 其中c9516_g1和c9897_g检测到的等位变异数最多, 为6个。期望杂合度的变化范围为0.278~0.861, 平均值为0.536。多态信息含量PIC的分布范围为0.239~0.855, 平均值为0.468(表3)。

图1

Fig. 1

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	图1 部分引物对5份白花草木樨种质的扩增结果 注:图中引物编号与表3相同。M, Marker, DL500DNA。Fig. 1 Amplification products from five Melilotus albus accessions using select primer pairs Note: Numbers of the primers refer to Table 3. M, Marker, DL500DNA.

用550对EST-SSR引物对5份白花草木樨种质进行扩增, 结果表明, 多态性EST-SSR标记位点的观测等位基因数(N_a)、期望等位基因数(N_e)、Nei’ s基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)的平均值分别为1.810、1.541、0.316和0.466。

白花草木樨5份种质的遗传距离介于0.455~0.580, Pop1、Pop3和Pop1与Pop4的遗传距离最大, 均为0.580; Pop1与Pop2遗传距离最小, 为0.455; 5份种质的遗传一致度介于0.550~0.634, Pop1与Pop2之间的遗传一致度最大, 为0.634(表4), 表明这两份种质间的遗传相似性最高。Pop1、Pop3和Pop1与Pop4的遗传一致度最小, 均为0.556, 表明这两份种质间的遗传相似性最低。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 5份种质的Nei’ s遗传一致度和遗传距离 Table 4 Nei’ s genetic similarity coefficient and genetic distance between five accessions Pop ID Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4 Pop 5 Pop 1 — 0.634 0.556 0.556 0.601 Pop 2 0.455 — 0.627 0.619 0.586 Pop 3 0.580 0.467 — 0.619 0.631 Pop 4 0.580 0.479 0.479 — 0.616 Pop 5 0.510 0.535 0.461 0.485 — 注:对角线右上方为遗传一致度, 对角线下方为遗传距离。 Note:The upper right of the diagonal is the genetic consistency, and below the diagonal is the genetic distance.

表4 5份种质的Nei’ s遗传一致度和遗传距离 Table 4 Nei’ s genetic similarity coefficient and genetic distance between five accessions