植物生长调节剂在牧草种子生产中的应用
陶奇波1, 白梦杰1, 韩云华1, 冯葆昌2, 王彦荣1
1.草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020
2.农业部全国畜牧总站,北京 100125
通信作者:王彦荣(1956-),女,吉林大安人,教授,博导,博士,主要从事牧草种质资源与种子学研究。E-mail:[email protected]

第一作者:陶奇波(1992-),男,甘肃天水人,在读博士生,主要从事牧草种子生产与良种扩繁研究。E-mail:[email protected]

摘要

优质的牧草种子是草业与畜牧业健康发展的物资保障。植物生长调节剂的推广使用为提高牧草种子产量开辟了新的途径。依据其作用效果,植物生长调节剂可以分为植物生长促进剂与植物生长抑制剂两大类,目前以后者在牧草种子生产中的应用最为广泛。本文结合国内外研究进展,就两大类植物生长调节剂在牧草种子生产中的应用与作用机理进行了总结,重点论述了其对种子产量以及产量构成因素的影响,并总结了目前研究中存在的问题,提出了相应的研究展望。

关键词: 植物生长调节剂; 牧草种子生产; 种子产量; 构成因素
中图分类号:S812.4 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2017)06-1238-09 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0048
Use of plant growth regulators in forage seed production
Tao Qi-bo1, Bai Meng-jie1, Han Yun-hua1, Feng Bao-chang2, Wang Yan-rong1
1.State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China
2.National Animal Husbandry & Veterinary Service of the Ministry of Agriculture (MOA), Beijing 100125, China;;
Corresponding author:Wang Yan-rong E-mail:[email protected]
Abstract

High-quality forage seeds are the foundation of good pastures for the livestock husbandry industry. The advent of plant growth regulators (PGRs) has created new methods for increasing seed production in grasses and legumes. Based on their effects, PGRs can be divided into two types: plant growth stimulators and plant growth inhibitors. Plant growth inhibitors have been widely used in forage seed production. This research detailed progress in the use and mechanism of PGRs for forage seed production. In particular, it illuminated the effect of PGRs on seed yield and seed yield components. Existing problems and developmental trends were also summarized to provide necessary information to improve future research.

Keyword: plant growth regulator; forage seed production; seed yield; seed components

牧草种子是草畜业最基本的生产资料, 其不仅在栽培草地建设和草地改良中具有重要作用, 也是生态建设、环境治理以及城市绿化的重要物质基础[1]。高产、稳定、优质的牧草种子生产是草畜产业安全发展的物资保障[2]。由于种子产量是一个易受环境影响的数量性状[3, 4, 5, 6], 且牧草育种专家在制定育种目标时, 首要考虑的是提升草产量或坪用特性[7, 8], 而以提高种子产量为育种目标的育种工作极其有限。因此, 选择气候适宜而且稳定的牧草种子生产地区, 并通过改良田间农艺措施来提高牧草种子产量就显得尤为重要。当下对牧草种子生产研究主要集中在密度调控[9, 10, 11]、施肥[12, 13, 14, 15]、灌溉[16, 17]以及收获后的残茬处理[18, 19]等方面。

植物生长调节剂的推广使用为提高牧草种子产量开辟了新的路径[20, 21]。已有研究表明, 科学、合理地在田间条件下施用植物生长调节剂, 或是将施用生长调节剂与其它田间管理措施配合使用, 可以有效提高牧草种子产量。本文在大量查阅国内外研究文献的基础上, 对植物生长调节剂在牧草种子生产中的应用进行综述。重点论述对种子产量及产量构成因素的影响, 并提出相应的研究展望, 以期为植物生长调节剂在牧草种子生产方面的科学研究与生产实践提供参考依据。

1 植物生长调节剂对牧草种子产量的影响

植物生长调节剂在农业生产中的利用最早见于农作物生产, 一般采用叶面喷施的方法, 用以优化植物同化产物的分配, 提高作物籽实产量。同样, 其在提高牧草种子产量方面亦有很大潜力。植物生长调节剂按照其作用效果可以分为植物生长抑制剂与植物生长促进剂两类。前者主要应用于营养生长旺盛, 倒伏情况严重的牧草, 一般应用于拔节早期, 用以控制其营养生长, 使其将更多的同化产物分配到生殖器官及种子发育中, 从而提高种子产量; 而后者主要应用于有性繁殖较弱的牧草, 一般应用于现蕾期或是盛花期, 主要目的在于促进小花发育, 提高结实率。

1.1 植物生长抑制剂对牧草种子产量的影响

种子产量是种子生产的首要问题。目前关于植物生长调节剂在提高牧草种子产量上的研究, 主要集中在植物生长抑制剂的应用, 这主要是因为相较于一年生作物, 草类植物营养生长旺盛而有性繁殖较弱, 倒伏现象比较严重。倒伏是影响作物产量的关键因素之一。有研究表明, 在发生严重倒伏的情况下, 多年生黑麦草(Lolium perenne)捕获光照能力降低或丧失, 光合有效辐射(PAR)减少, 导致旗叶光合作用减弱, 以至于产量降低[22]。通过分析高羊茅(Festuca arundinace)、多花黑麦草(Lolium multiflorum)及多年生黑麦草的干物质量、碳水化合物含量、种子产量与倒伏率的关系, 发现倒伏显著降低了这3种禾草的干物质量、碳水化合物含量以及种子产量[23]。而植物生长抑制剂的使用则有利于矮化植株, 尤其控制作物基部1-3节的长度, 使基部茎秆粗壮, 有效分蘖数增加, 从而增强植株抗倒伏能力, 提高收获指数及种子产量。研究[24]表明, 小麦(Triticum aestivum)叶片喷施植物生长抑制剂抗倒酯(trinexapac-ethyl, TE), 可使其叶长缩短, 叶宽增加, 叶绿素含量增加, 同时大大提高植物的光合速率, 抗倒酯对小麦倒伏的调控主要体现在降低株高、缩短节间以及加粗茎秆等方面, 抗倒伏能力的提高为小麦高产提供了保证。此外, 多年生禾草种子败育严重, 抗倒酯等植物生长抑制剂的使用有助于减少败育, 提高种子结实率[25]。常用植物生长抑制剂有以下几种。

1.1.1 矮壮素(chlormequat chloride, CCC) 矮壮素是一种常用的植物生长延缓剂, 可以抑制植物细胞伸长, 但不抑制其分裂, 因此可以降低株高。在甘肃酒泉通过3年的田间试验证明, 在5 kg a.i.· hm-2的用量下, 矮壮素的施用显著提高了紫花苜蓿(Medicago sativa)的种子产量及收获指数, 同时显著降低了其地上部分生物量与倒伏[8]。矮壮素与多效唑、抗倒酯配合使用可使多年生黑麦草种子增产95%, 同时株高降低38%[26]。田间试验研究表明, 拔节期配合施用矮壮素与抗倒酯使鸭茅(Dactylis glomerata)种子增产最高可达86%, 且在不配合灌溉措施的情况下, 平均产量增加27%[27]。施用有效浓度为0.15 kg· hm-2矮壮素, 可使海法白三叶(Trifolium repens cv.Haifa)冠层高度降低, 同时显著提高其花梗长度, 表明矮壮素的施用使同化物更多地向生殖生长分配, 潜在种子产量与实际种子产量亦显著提高[28]。多年生黑麦草种子产量也可由矮壮素进行调控, 两年的试验研究表明, 3 kg a.i.· hm-2的矮壮素用量可使其种子产量显著提高, 两年平均增加39%, 平均产量达到了1 046 kg· hm-2。同时, 矮壮素的施用也显著降低了倒伏、营养枝干重等指标[29]。亦有研究通过田间试验证明了0.75 g a.i.· hm-2抗倒酯有效提高了扁穗雀麦(Bromus willdenowii)种子产量, 同时降低其干物质产量与生殖枝长度[30]。在利用矮壮素提高牧草种子产量的研究中, 施用浓度亦是最为关键的因素之一, 过高的浓度不利于种子产量的提高, 甚至造成病害。高浓度矮壮素的利用会造成紫花苜蓿坏疽病的发生[31]

1.1.2 抗倒酯 抗倒酯是环己羧酸类植物生长抑制剂, 目前在牧草种子生产中的研究与应用最为广泛。其可抑制赤霉素(gibberellin acid)生物合成的后期过程[32], 从而延缓植物伸长生长。同时, 施用抗倒酯可以增加土壤中细菌数目[33], 改善植物生存环境, 为植株健康生长提供保障。有研究表明, 在9种不同的倒伏环境中, 施用400以及600 g a.i.· hm-2的抗倒酯均可以显著提高多年生黑麦草的结实率、实际种子产量与收获指数, 最高种子产量达到了2 090 kg·hm-234, 并缓解了倒伏现象的发生, 其最佳的施用时期在拔节期(BBCH 32)[35], 而抗倒酯的施用对多年生黑麦草地上部分生物量无显著影响。相关结果亦可见Chastain等[36]在高羊茅上的研究。多年生黑麦草种子产量随抗倒酯的施用平均增加44%, 同时, 使植株倒伏率达到50%的天数从7 d增加到33 d, 植株倒伏率达到50%的天数每推迟一天, 种子产量平均增加24 kg· h m-237。抗倒酯与其它一些田间管理措施相配合同样可以有效提高牧草种子产量。春季施用氮肥, 配合拔节期(BBCH 32-33)施用200 g a.i.· hm-2抗倒酯, 显著提高多年生黑麦草与高羊茅种子产量, 推荐的氮肥施用量分别为180与135 kg· hm-2, 两个草种3年平均增产114%与89%, 氮肥与抗倒酯的交互作用对多年生黑麦草与高羊茅种子产量影响显著, 但对收获指数无明显影响[38]。这与在多年生黑麦草上的研究类似[39]。关于匍匐紫羊茅(Festuca rubra)上的研究[40]结果显示, 春季施用抗倒酯配合火烧残茬, 可使种子产量达到最大, 并显著提高收获指数。同时, 在不适宜进行野外火烧的地区, 施用抗倒酯也是对火烧残茬的一种很好的替代, 同时, 在紫羊茅上的研究也得到了类似的结果[41]。通过抗倒酯在多花黑麦草种子生产中的应用研究[42], 认为施用量为423 g a.i.· hm-2, 种子产量达到最大, 为2 633 kg· hm-2

1.1.3 多效唑(paclobutrazol, PP333) 多效唑是一种三唑类植物生长抑制剂, 可抑制赤霉素合成的早期过程[43]。其具有延缓植物生长[44]、提高植物分蘖能力、促进成花结实的功能, 并能在一定程度上增加植物抗逆性。庞茜和赵秀兰[45]研究发现, 多效唑可以提升多花黑麦草抗旱能力。多效唑广泛应用于牧草种子生产, 具有增加种子产量, 提高种子质量的效果[46]。高羊茅种子产量在500 g a.i.· hm-2的多效唑用量下显著提高, 达到528 kg· hm-2, 较对照增加了111%, 此时增加浓度, 则种子产量下降。高羊茅株高则随多效唑施用浓度增加而显著降低[47]。在甘肃酒泉地区的研究[48]表明, 春施30 g a.i.· hm-2的多效唑, 配合施用150 kg· hm-2氮肥, 可使蓝茎冰草(Agropyron smithii)达到最大种子产量, 为550.9 kg· hm-2。多效唑与抗倒酯、矮壮素配合使用可使多年生黑麦草种子增产95%, 同时株高降低38%, 推荐的多效唑浓度为250 g·L-126。在内蒙古乌海对紫花苜蓿种子生产性能进行了研究, 认为0.8 kg a.i.· hm-2是多效唑在紫花苜蓿种子生产中的最佳用量, 此时紫花苜蓿潜在种子产量以及实际种子产量分别达到了1 675.71和111.39 kg· hm-2, 较对照分别提高28.6%和39.5%[49]。亦有研究[50]表明, 抽穗初期喷施多效唑, 可使多年生黑麦草种子产量平均增产50.8%, 同时, 降低了株高以及倒伏现象的发生。在有灌溉存在以及无灌溉存在两种条件下探究了多效唑对多年生黑麦草种子生产的影响, 认为在无灌溉条件下, 多效唑对植株生长并无任何延缓作用, 而在有灌溉处理的情况下, 多效唑对植株生长表现出显著的抑制作用[51]。在两种情况下, 喷施多效唑均能显著提高多年生黑麦草种子产量, 使其分别增产117%与86%。将多效唑与除真菌剂结合使用, 同样可以显著提高多年生黑麦草种子产量[52]。此外, 相较于EL500等植物生长抑制剂, 多效唑对种子增产作用更加明显[53]。对多效唑的最佳施用时期进行研究, 发现在二棱、抽穗初期以及初花期施用多效唑均可显著提高多年生黑麦草种子产量与收获指数, 而以抽穗初期为最佳时期[54]。然而, 亦有研究[55]表明, 0.25、0.5以及1.0 kg a.i.· hm-2的多效唑施用可以显著降低白三叶叶柄长度, 但是对种子产量影响不明显。

1.2 植物生长促进剂对牧草种子产量的影响

植物生长促进剂在牧草种子生产中的研究与应用相对较少, 常见的植物生长促进剂包括萘乙酸(NAA)、赤霉素以及油菜素内酯(BR)等。大量在作物上的研究表明, 萘乙酸、赤霉素以及油菜素内酯等植物生长促进剂均能有效提高作物抽穗、开花、灌浆等生长发育关键时期的光合速率、叶绿素含量以及保护酶活性, 促进小花发育, 提高结实率, 从而提升作物产量。在扬花期与灌浆期两次施用油菜素内酯, 显著提高了小麦叶绿素含量、光合速率以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性, 同时提高了小麦灌浆速率, 从而达到增产的目的[24]。通过研究在不同时期施用α -萘乙酸、赤霉素以及6-苄基腺嘌呤(6-BA)对草地早熟禾(Poa pratensis)种子生产性能的影响, 认为除孕穗期施用NAA外, 各时期施用上述3种植物生长促进剂均可显著提高种子产量, 最高种子产量出现在返青期施用NAA, 种子产量达到744.4 kg· hm-2, 较对照提高了25.9%[56]。有学者认为萘乙酸对作物产量的增加作用主要体现在干物质积累的增加以及生长速率的提高[57], 其可能原因在于萘乙酸等植物生长调节剂对植物内源激素含量与分配的改变, 进而对植物内部相关基因表达产生了影响, 最后通过运输与分配表达产物从而调控作物生长以及产量。3年的田间试验表明, 在花芽形成期与盛花期各喷施萘乙酸、赤霉素、油菜素内酯(BR)、三十烷醇(TRIA)与复硝酚钠(SON)后, 紫花苜蓿种子产量与收获指数显著上升, 其中以萘乙酸效果最好, 20 g a.i.· hm-2的萘乙酸喷施, 可使3年平均种子产量达到922 kg· hm-2, 较对照增加29.3%, 收获指数增加29.5%, 但是上述5种植物生长促进剂的施用, 均不影响紫花苜蓿的地上部分生物量[8]。也有研究表明, 萘乙酸对紫花苜蓿种子产量无显著影响[49], 与上述研究结果不一致, 这种差异可能是由于试验地环境、土壤、供试品种等多种因素造成的, 萘乙酸用量过大, 会降低紫花苜蓿的种子产量[58]。此外, 有研究结果也表明, 在侧芽形成期施用赤霉素对紫花苜蓿种子产量无明显影响[59]。狗牙根(Cynodon dactylon)种子产量亦随几种植物生长促进剂的施用而提高。有研究表明, 在分蘖-拔节期喷施50 mg· kg-1 2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)与200 mg· kg-1赤霉素, 均可以显著提高狗牙根实际种子产量, 而以前者效果最好, 狗牙根种子产量较对照提升了32.6%, 达到了600.5 kg·hm-260

综上所述, 植物生长调节剂的合理使用可以有效提高各种牧草的种子产量, 对于某种特定的牧草, 往往有最适宜于其种子生产的植物生长调节剂以及用量、施用时期等, 表1总结了几种常见牧草在施用植物生长调节剂的情况下所能达到的最大种子产量。

表1 几种牧草在施用植物生长调节剂的情况下所能达到的最大种子产量 Table 1 Highest seed yield of several grasses using plant growth regulators
2 植物生长调节剂对牧草种子产量构成因素的影响

牧草种子产量是由若干个产量构成因素组成的, 具体包括单位面积的生殖枝数、每个生殖枝上的花序数、每个花序上的小花数、每个小花中的胚珠数以及平均种子重量(种子千粒重), 这5个因素构成了牧草种子产量组成成分[61]。而对于禾本科牧草而言, 种子产量构成因素则可以表述为单位面积生殖枝数、每生殖枝上的小穗数、每小穗上的小花数、每小花内的种子数以及平均种子重量(种子千粒重)[62]

2.1 植物生长调节剂对单位面积生殖枝的影响

一般每种牧草的种子生产都需要一定量的单位面积生殖枝数作为产量的保障。有报道称在高羊茅[63]以及羊草(Leymus chinensis)[64]等草种子生产中, 单位面积生殖枝数是最为重要的种子产量构成因素。拔节期(BBCH 32)施用有效浓度为500 g· hm-2抗倒酯, 可使红三叶(Trifolium pratense)单位面积的生殖枝数目增加20.5%[65]。研究[48]发现, 当施氮量小于150 kg· hm-2时, 多效唑的使用不会提高蓝茎冰草的单位面积生殖枝数, 但当施氮量达到150 kg· hm-2, 则单位面积的生殖枝数目大幅度提高, 提高比例达124%, 这显示出植物生长调节剂对单位面积生殖枝数的调控, 与施肥等其它管理措施密切相关。这与研究者对蓝茎冰草种子生产的研究结果类似[66], 即在水分匮缺的情况下, 喷施多效唑对其单位面积生殖枝数目影响不显著, 但当生长季灌溉次数达到4次的时候, 喷施多效唑可以显著提高蓝茎冰草单位面积生殖枝数目。当没有施肥以及灌溉作为基础的时候, 多效唑的喷施则不影响蓝茎冰草的单位面积生殖枝数目[67]。研究表明150~450 mg· hm-2的多效唑处理可以显著提高多花黑麦草单位面积的穗数, 当浓度达到600 mg· hm-2, 则单位面积穗数显著降低[68], 亦有报道显示在某些特定年份, 抗倒酯的施用显著降低了多年生黑麦草以及高羊茅的生殖枝数目[38]

2.2 植物生长调节剂对每个生殖枝上的花序数的影响

植物生长调节剂对每个生殖枝上的花序数目影响有限。紫花苜蓿每茎秆上的总状花序数量随着生长素(20 g a.i.· hm-2)与赤霉素(20 g a.i.· hm-2)的施用而显著提高, 然而在2008年, 矮壮素(5 kg a.i.· hm-2)的使用会降低其每茎秆上的总状花序数, 这主要是因为矮壮素显著降低了紫花苜蓿株高, 导致花序着生部位减少, 从而花序数量减少[8]。多花黑麦草每生殖枝上的小穗数目随多效唑的施用而显著减少[50]。研究显示抗倒酯的施用对紫羊茅小穗数无显著影响[41], 类似的报道亦可见于红三叶[65]、高羊茅[36]以及多年生黑麦草[37]

2.3 植物生长调节剂对每个花序上的小花数的影响

大量研究表明施用植物生长调节剂对每花序上的小花数有显著影响。在特定年份, 早春施用400 g a.i.· hm-2抗倒酯可以显著提高紫羊茅每小穗内的小花数, 从而提高了种子产量[41]。拔节期施用500 g a.i.· hm-2抗倒酯, 红三叶每个花序上的小花数较对照提高了8%[65]。研究表明, 在60 kg· hm-2的施氮量下, 300 g a.i.· hm-2的多效唑施用会显著提高蓝茎冰草每小穗内的小花数, 在其它施氮量下, 该效应则不显著[48]。在云南昆明通过田间试验证明1 kg a.i.· hm-2多效唑或者150 g a.i.· hm-2矮壮素可以显著提高白三叶每花序内的小花数[28]。学者研究了400 g a.i.· hm-2的抗倒酯施用对多花黑麦草小穗顶部、中部以及基部小花数目的影响, 发现抗倒酯的施用虽然在一定程度上提高了小穗上各部位的小花数目, 但是相比对照无显著性差异, 同时认为小花数对多花黑麦草种子产量无任何影响[34]。类似结果同样在高羊茅[36]以及多年生黑麦草[37]上有过报道, 即抗倒酯施用并不会对每花序上的小花数产生显著影响。

2.4 植物生长调节剂对每个小花内的胚珠数(种子数)的影响

不同植物每小花内所含胚珠数目不同, 禾本科植物通常每小花内只含有1枚胚珠, 豆科牧草则因物种而异。通常并不是每一枚胚珠都能发育为一粒种子。植物生长调节剂对每小花内的胚珠数或者种子数影响有限。研究发现, 施用多效唑或矮壮素不影响白三叶每小花内的胚珠数[28], 类似的结果也在紫花苜蓿上有所报道[49]

2.5 植物生长调节剂对种子平均重量(种子千粒重)的影响

各种牧草种子的重量是由其遗传基础所决定的, 一般情况下变异较小。200~600 g a.i.· hm-2抗倒酯并不影响高羊茅种子重量, 同时种子重量也对种子产量不起决定性作用[36]。相同的结果出现在多花黑麦草上的研究上[34]。多年生黑麦草种子重量亦不受抗倒酯施用的影响[37, 39]。然而, 也有研究表明植物生长调节剂与其它田间管理措施相配合可以影响牧草种子重量。在施氮肥条件下, 抗倒酯显著影响多年生黑麦草与高羊茅的种子重量[38], 抗倒酯与火烧残茬配合使用同样可以提高匍匐紫羊茅的种子重量, 这可能是因为抗倒酯的施用延长了种子灌浆周期, 从而提高了种子重量[41]

3 存在的问题与今后的研究建议

自20世纪80年代中期以来, 国内外草业科技工作者就植物生长调节剂在牧草种子生产中的应用进行了一系列研究, 取得了可喜成果, 有力指导了生产实践。可以看到, 矮壮素、抗倒酯、多效唑以及萘乙酸等均是较为常用的植物生长调节剂, 以上几种植物生长调节剂在实际应用中各有利弊(表2), 需要根据具体的草种以及生产环境、田间管理措施选择最为适当的生长调节剂, 或是将几种生长调节剂配合使用。

表2 几种常用的植物生长调节剂比较 Table 2 Comparison of several commonly used plant growth regulators

综上所述, 植物生长调节剂在牧草种子生产中具有广阔的应用前景, 通过对植物的生长发育进行调控, 控制营养生长, 使植物将更多的同化产物应用于生殖生长, 可以显著提高牧草种子产量。然而, 对植物生长调节剂的应用目前还存在一定的局限性。

1)所使用的植物生长调节剂种类较少, 集中在几种常见的植物生长抑制剂中, 如矮壮素、抗倒酯、多效唑等, 应该加强一些新型的植物生长调节剂尤其是植物生长促进剂的研究。

2)以萘乙酸、油菜素内酯等为代表的植物生长促进剂价格昂贵, 限制了其推广应用, 因此, 有必要对其的一些相对廉价的类似物进行研究, 以降低生产成本, 便于推广。

3)研究草种较为有限, 目前国内外研究主要集中在一些常见豆科或禾本科牧草, 例如紫花苜蓿、多年生黑麦草、多花黑麦草、高羊茅以及白三叶等。今后的研究工作应加强羊草、老芒麦(Elymus sibiricus)、无芒隐子草(Cleistogenes songorica)等一些常用牧草尤其是重要乡土草种的研究。

4)相对于传统农药, 植物生长调节剂的用量普遍较小, 导致在实际应用中操作不便。开发出简单易行的操作规程, 使生长调节剂能够均匀的施用于田间亦是今后研究的重点之一。

5)目前的研究较为表观, 多数研究只关注了植物生长调节剂对种子产量以及产量构成因素的影响, 缺乏针对机理方面的研究, 今后的工作应该从植物生理学、植物生物化学以及分子生物学的角度入手, 加强植物生长调节剂影响牧草种子生产的机理研究;

6) 较少关注植物生长调节剂在牧草种子生产中所产生的环境代价。有研究表明, 植物生长调节剂的使用会造成一系列不良环境后果, 例如土壤污染[20, 69, 70]。在充分发挥植物生长调节剂增产作用的同时, 最大限度降低环境代价, 也是草业科技工作者的重要任务之一。

(责任编辑 苟燕妮)

The authors have declared that no competing interests exist.

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