旱、盐胁迫下黄芪种子萌发及其对水杨酸的响应
王楠1, 高静2, 黄文静1, 李铂1, 唐志书1, 宋忠兴1
1.陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心,陕西 咸阳 712083
2.陕西中医药大学药学院,陕西 咸阳 712046
通讯作者:高静(1986-),女,山东淄博人,讲师,博士,主要从事中药资源与鉴定研究。E-mail:[email protected],共同通信作者:唐志书(1972-),男,陕西镇巴人,教授,博士,主要从事中药资源利用研究。E-mail:[email protected]

第一作者:王楠(1983-),男,甘肃兰州人,讲师,博士,主要从事药用植物生理生态研究。E-mail:[email protected]

摘要

通过测定不同浓度聚乙二醇(PEG)和NaCl胁迫下膜荚黄芪( Astragalus membranaceus)和蒙古黄芪( A. membranaceus var. mongholicus)种子的最终发芽率、发芽势、简化活力指数、苗长、根长、苗干重、根干重等指标,以及不同施用方式和浓度的水杨酸(SA)对重度PEG和NaCl胁迫下两种黄芪种子最终发芽率的影响,旨在研究两种黄芪种子对PEG和NaCl胁迫响应方式的异同及SA对两种黄芪种子在重度PEG和NaCl胁迫下保护效果的差异。结果表明,低浓度PEG和NaCl只能促进膜荚黄芪种子萌发。在-0.5 MPa PEG和-0.7 MPa NaCl处理下,蒙古黄芪种子的活力指数显著优于膜荚黄芪种子( P<0.05)。SA浸种能促进重度PEG和NaCl胁迫下两种黄芪种子的最终发芽率。蒙古黄芪种子的耐胁迫性高于膜荚黄芪种子。两种黄芪种子对SA的响应方式有区别。SA浸种处理优于拌种处理。

关键词: 膜荚黄芪; 蒙古黄芪; 种子萌发; 水杨酸; PEG; NaCl
中图分类号:S567.903.4;Q945.34 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2018)01-0106-09
Variations in seed germination and salicylic acid protective effect between two cultivars of Astragalus membranaceus under drought and salt stress
Wang Nan1, Gao Jing2, Huang Wen-jing1, Li Bo1, Tang Zhi-shu1, Song Zhong-xing1
1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, Shaanxi, China
2. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi, China
Corresponding author: Gao Jing E-mail:[email protected];Tang Zhi-shu E-mail:[email protected]
Abstract

To study the variations in seed germination between Astragalus membranaceus and A. membranaceus var. mongholicus under polyethylene glycol (PEG) and NaCl stresses, and to explore the differences in protective effects of salicylic acid (SA) for the two cultivars of A. membranaceus under severe PEG and NaCl stresses, we measured (1) the total germination percentage (TGP), germination energy (GE), vigor index (VI), shoot length (SL), root length (RL), shoot dry weight (SDW), and root dry weight (RDW) of two cultivars of A. membranaceus under gradually enhanced PEG and NaCl stresses; and (2) the differences in TGP of the two cultivars between application methods and concentrations of SA under severe PEG and NaCl stresses. Our results showed that all measurements of the two cultivars decreased with increasing stress intensity. Both low concentrations of PEG and NaCl can enhance seed germination in A. membranaceus. The VI in A. membranaceus var. mongholicus was higher than in A. membranaceus at -0.5 MPa PEG and -0.7 MPa NaCl stress levels ( P<0.05). Soaking seeds with SA can enhance the TGP of of A. membranaceus. and A. membranaceus var. mongholicas The stress tolerance of A. membranaceus var. mongholicus was stronger than A. membranaceus. There were significant differences in seed performances between the two cultivars treated with SA. Soaking seeds with SA is was more effective than mixing seeds with SA.

Key words: Astragalus membranaceus; Astragalus membranaceus var. mongholicus; seed germination; salicylic acid; PEG; NaCl

黄芪在中国药典中规定为豆科草本植物膜荚黄芪(Astragalus membranaceus)或蒙古黄芪(A. membranaceus var. mongholicus)的干燥根[1]。黄芪产地分布广泛, 甘、陕、川、晋、蒙和东北等地均有种植[2]。传统中医药理论和实践认为, 黄芪具有益气升阳、行气利水、固表止汗等作用[3], 而现代医学研究和化学分析证实, 黄芪含有皂苷、多糖、黄酮、氨基酸、叶酸、胆碱等多种化学成分及微量元素, 更加深入的药理研究则阐明黄芪具有增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、降血糖等功效[4], 可以应用于治疗多种病症并取得较好的临床效果。随着对黄芪临床应用方面研究的不断深入, 黄芪应用范围也在不断扩展, 从而导致对黄芪的需求也逐年增多。

随着社会发展, 工业给人类带来福祉的同时也带来了负面影响。环境破坏、土壤污染与退化问题日益凸显, 干旱和盐渍化成为制约生态系统健康的关键问题之一。种子顺利萌发是生态系统重要的组成环节。干旱和土壤盐碱化阻碍种子萌发且对胚的生长发育产生不良影响[5, 6]。近年来, 有关干旱和盐胁迫影响黄芪种子萌发的研究已有大量报道[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13], 但这类研究均仅选择膜荚黄芪或蒙古黄芪之一作为研究对象, 没有将二者放入同一试验环境中进行对比。膜荚黄芪属于森林草甸中生植物, 而蒙古黄芪则属于旱中生植物[14], 原初适生环境的不同能导致应对同类胁迫时响应不同。因此, 研究两种黄芪种子应对干旱和盐胁迫时的差异化现象能为今后在环境气候渐变趋势下的选种育种工作提供理论支撑。此外, 目前只有极个别研究探索植物生长发育调节物质— — 水杨酸(salicylic acid, SA)如何影响黄芪种子萌发[15, 16], 而SA对黄芪种子的抗逆性是否有促进作用也鲜见报道。

种子萌发受到内部生理和外部环境的双重调控, 其生长模式常被用作表征种子生活力和抗逆性的重要指示因子。因此, 以膜荚黄芪和蒙古黄芪为材料, 研究两种黄芪种子的萌发趋势和幼苗发育在等渗压力的干旱和盐胁迫梯度下响应方式的异同, 探索两种黄芪在干旱和盐胁迫下的耐受性差异, 为两种黄芪响应生境恶化提供理论支持; 重度胁迫下两种黄芪种子对外源SA施用形式的响应异同, 筛选有效缓解旱/盐害、提高黄芪幼苗耐受性的最适SA浓度及施用方式, 促进黄芪资源在渐变环境尺度下的可持续发展。

1 材料与方法
1.1 材料

膜荚黄芪和蒙古黄芪种子均采收于甘肃省宕昌县县域内。由陕西中医药大学药学院高静老师鉴定。膜荚黄芪种子千粒重1.40 g, 蒙古黄芪种子千粒重1.65 g。种子存放在干燥阴凉通风的实验室。NaCl和PEG均为分析纯。

1.2 试验设计

选取籽粒健壮饱满、大小均匀的足量膜荚黄芪和蒙古黄芪种子, 用1%高锰酸钾消毒20 min后, 蒸馏水冲洗至净, 去除种子表面浮水后待用。

用PEG6000(此后简称PEG)和NaCl溶液模拟干旱胁迫和盐胁迫。试验1:干旱和盐胁迫对两种黄芪种子萌发的影响。分别将PEG和NaCl按溶解浓度配制成5个水势胁迫梯度, 即对照0(CK), -0.1, -0.3, -0.5, -0.7 MPa。试验2:重度干旱和盐胁迫下SA及其施用方式对两种黄芪种子萌发的影响。试验处理设定值参考预试验结果, 将发芽率只有20%左右的胁迫强度设定为研究水势, 即PEG为-0.6 MPa、NaCl为-0.9 MPa; 在预试验中当SA浓度≥ 0.4 mmol· L-1时对黄芪种子萌发产生抑制, 所以SA设定3个浓度, 即0.1、0.2和0.3 mmol· L-1

选择SA拌种和浸种两种方法。拌种:将SA分别与PEG和NaCl配制成符合研究条件水势的溶液, 加入种子发芽床, 使SA始终贯穿整个处理过程。浸种:将黄芪种子浸泡于SA溶液24 h后用蒸馏水冲洗至净后置入发芽床, 此后种子不再与SA接触。试验在垫有两层滤纸的90 mm培养皿中实施, 每个培养皿中30粒种子, 重复3次。本研究在室温和自然光照交替下进行, 以期温度和光照不作为种子的促进或限制因素。

1.3 种子萌发指标测定

每日观察并记录发芽种子数, 发芽9 d后所有处理均无新种子萌发。最终发芽率(total germination percentage, TGP)=发芽种子数/供试总种子数; 发芽势(germination energy, GE)=发芽高峰时段内的发芽数/供试总种子数%, 本研究中采用前4 d的数据; 简化活力指数(vigor index, VI)=TGP× S, S为幼苗生长势, 用萌发后第10天的幼苗平均长度表示。相对PEG或NaCl伤害率(relative damage rate, RDR)=(对照发芽率-处理发芽率)/对照发芽率; 相对发芽率(relative germination rate, RGR)=处理发芽率/对照发芽率。

1.4 幼苗生长指标测定

萌发10 d, 从各重复中随机取出10株幼苗, 测定苗长(shoot length, SL)、根长(root length, RL)、苗干重(shoot dry weight, SDW)、根干重(root dry weight, RDW)。测干重前先105 ℃烘2 h杀青, 后80 ℃烘24 h至恒重。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件和IBM SPSS Statistics 21统计分析软件对最终发芽率、发芽势、活力指数、苗长、根长、苗重和根重进行处理和差异显著性检验(LSD法)。

2 结果与分析
2.1 PEG和NaCl胁迫对膜荚黄芪和蒙古黄芪种子萌发指标的影响

与对照相比, 当PEG和NaCl为-0.1 MPa时, 均对膜荚黄芪种子萌发有促进作用, 但对蒙古黄芪种子却无促进作用(图1)。当PEG和NaCl< -0.3 MPa时开始抑制膜荚黄芪种子萌发; 而当PEG< -0.3 MPa和NaCl< -0.5 MPa时开始抑制蒙古黄芪种子萌发(P< 0.05)。-0.1 MPa的NaCl对膜荚黄芪种子发芽势有显著的促进作用(P< 0.05)(表1)。当PEG和NaCl< -0.3 MPa时, 膜荚黄芪种子和蒙古黄芪种子的发芽势开始下降(P< 0.05)。当PEG和NaCl为-0.1 MPa时, 膜荚黄芪种子的简化活力指数不受影响; NaCl为-0.1 MPa时, 蒙古黄芪种子的简化活力指数不受影响(P> 0.05)。其他处理下, 两种黄芪种子的简化活力指数均下降(P< 0.05)。总体而言, 随着胁迫的增强, 两种黄芪种子的最终发芽率, 发芽势和简化活力指数均呈现下降趋势。

图1 膜荚黄芪种子在PEG、NaCl胁迫下和蒙古黄芪种子在PEG、NaCl胁迫下的累积发芽率Fig. 1 The cumulative germination of A. membranaceus under PEG and NaCl stresses and A. membranaceus var. mongholicus under PEG and NaCl stresses

表1 PEG和NaCl对膜荚黄芪种子和蒙古黄芪种子的最终发芽率、发芽势、简化活力指数、苗长、根长、相对伤害率和相对发芽率的影响 Table 1 Total germination percentage (TGP), germination energy (GE), vigor index (VI), shoot length (SL), root length (RL), relative damage rate (RDR) and relative germination rate (RGR) of A. membranaceus (A) and A. membranaceus var. mongholicus (AM) under PEG and NaCl stresses
2.2 PEG和NaCl胁迫对膜荚黄芪和蒙古黄芪幼苗生长发育的影响

全部PEG胁迫和NaCl< -0.3 MPa时, 对膜荚黄芪幼苗长显著抑制(P< 0.05)(表1); PEG和NaCl都< -0.1 MPa时对蒙古黄芪幼苗长显著抑制。当PEG< -0.1 MPa和NaCl< -0.3 MPa时, 对膜荚黄芪和蒙古黄芪根长显著抑制(P< 0.05)。上述抑制作用均随胁迫强度加剧而增加。不同处理对种子萌发和生长的促进或抑制通过相对伤害率值体现。当PEG和NaCl为-0.1 MPa时对膜荚黄芪种子有益, 当NaCl为-0.1 MPa时对蒙古黄芪种子无害。其他处理下, 随着PEG和NaCl胁迫强度不断增加, 对两种黄芪种子的伤害程度也在不断加剧。如图2所示, 膜荚黄芪和蒙古黄芪幼苗及根部干重均随PEG和NaCl胁迫强度增加而减少。两种黄芪苗干重相对下降幅度基本一致, 而根干重下降变化存在差异。在-0.5 MPa PEG和-0.7 MPa NaCl胁迫下, 膜荚黄芪根部干重下降幅度多于蒙古黄芪。

图2 PEG和NaCl胁迫对膜荚黄芪和蒙古黄芪的苗干重和根干重的影响
不同小写字母和大写字母分别表示膜荚黄芪和蒙古黄芪在不同胁迫下干重差异显著性(P< 0.05)。
Fig. 2 The shoot dry weight and root dry weight of A. membranaceus and A. membranaceus var. mongholicus under PEG and NaCl stresses
Different lowercases and capital letters indicate significant differences among different treatments of dry weight of A. membranaceus and A. membranaceus var. mongholicus at the 0.05 level.

2.3 水杨酸对重度PEG和NaCl胁迫下膜荚黄芪和蒙古黄芪种子萌发的影响

如图3所示, 对于两种黄芪而言, 水杨酸(SA)在促进重度PEG和NaCl胁迫下种子萌发均是浸种方式要好于拌种方式。重度PEG胁迫下, 膜荚黄芪种子在0.1、0.2和0.3 mmol· L-1SA拌种处理下, 发芽率分别是15%、9%和8%, 均小于重度PEG胁迫对照发芽率(17%); 而在SA浸种处理下, 发芽率分别是76%、70%和83%, 接近空白对照水平(88%)。重度NaCl胁迫下, 膜荚黄芪种子在0.1、0.2和0.3 mmol· L-1拌种处理下, 发芽率分别是21%、22%和11%, 前两个处理与重度NaCl胁迫对照发芽率(21%)无显著差异(P> 0.05), 最后的处理显著小于胁迫对照(P< 0.05); 而在SA浸种处理下, 发芽率分别是6%、34%和43%, 显著高于重度NaCl胁迫对照发芽率(21%)。重度PEG胁迫下, 蒙古黄芪在3种SA浓度的拌种处理下, 发芽率分别是7%、9%和0, 均显著小于重度PEG胁迫对照发芽率(18%); 而在SA浸种处理下, 发芽率分别是84%、54%和1%, 0.1 mmol· L-1 SA浸种处理达到空白对照水平(82%)。重度NaCl胁迫下, 蒙古黄芪在3种SA浓度的拌种处理下, 发芽率分别是12%、12%和14%, 与重度NaCl胁迫对照发芽率(14%)无显著差异; 而在SA浸种处理下, 发芽率分别是29%、30%和43%, 显著高于重度NaCl胁迫对照发芽率(14%)。

图3 水杨酸拌种(MS)和浸种(SS)处理对膜荚黄芪种子在重度PEG、重度NaCl胁迫下和蒙古黄芪种子在重度PEG、重度NaCl胁迫下的发芽率Fig. 3 The germination rate of A. membranaceus under severe PEG and severe NaCl stresses and A. membranaceus var. mongholicus under severe PEG and severe NaCl stresses between mixing seed with SA (MS) and soaking seed with SA (SS)

3 讨论与结论

种子萌发时遭受到干旱和盐胁迫, 其膜系统、酶活性和生理代谢过程均会发生变化[17, 18, 19, 20]。本研究结果符合前人总结趋势, 最终发芽率、发芽势、简化活力指数、苗长、根长、苗干重和根干重均随PEG和NaCl胁迫强度的增加而下降。

膜荚黄芪种子和蒙古黄芪种子在轻微干旱和盐胁迫下有不同的响应方式。PEG和NaCl均为-0.1 MPa时对膜荚黄芪种子的萌发具有促进作用。适度干旱能够促进种子萌发已在多种植物包括膜荚黄芪上被证实[7, 21, 22], 有观点认为其作用机理可以从种子吸胀过程中防止膜损伤加快膜修复的膜系统保护机制和加速新陈代谢及核酸产生的酶活性角度于以解释[23]。低浓度NaCl对膜荚黄芪种子萌发具有促进作用也已有报道, 其原因被推测为低浓度NaCl溶液提供了适宜浓度的离子从而激活部分酶活性或是由于Na+进入到种子中, 降低了水势, 从而促进吸胀吸水[10, 18]。同时, 也有研究报道了低浓度PEG或NaCl也能促进蒙古黄芪种子萌发[8, 9]。但是, 在本研究中, 蒙古黄芪种子置于-0.1 MPa的PEG和NaCl下均无促进作用。杨祎辰等[9]使用不同浓度PEG处理蒙古黄芪种子24~48 h后随即停止胁迫, 韩多红等[8]使用NaCl+Na2CO3混合溶液对蒙古黄芪种子进行处理, 这与本研究所使用的持续PEG胁迫和NaCl单一处理有着本质不同。蒙古黄芪作为一种旱中生植物, 它的适生地时常遭遇轻度干旱和盐碱胁迫, 那么它的种子能否被低浓度PEG或NaCl所影响或者不受胁迫所影响的浓度范围是多少还需要进一步地研究。

在本研究中, 随着高浓度PEG和NaCl的施用, 两种黄芪种子的最终发芽率、发芽势、简化活力指数、苗长、根长、苗干重和根干重均被明显抑制。在-0.5 MPa PEG和-0.7 MPa NaCl下, 两种黄芪种子的耐受性差异明显, 蒙古黄芪种子萌发及苗长和根长较对照的下降幅度显著小于膜荚黄芪种子较对照的下降幅度(P< 0.05)。因此, 蒙古黄芪作为旱中生植物, 其旱/盐耐受力要强于膜荚黄芪。本研究中, 虽然PEG和NaCl均能抑制两种黄芪种子萌发, 但是在等渗条件下, PEG的效果要强于NaCl。由于高浓度NaCl下种子的发育表现要好于高浓度PEG下的种子, 所以可以认为NaCl提供的离子效应在本研究中是一种正效应或能与渗透胁迫相拮抗, 从而减轻种子遭受渗透胁迫程度, 其原因推测为:溶液中的Na+进入到细胞中, 降低细胞水势, 从而促进吸水[18]

目前, 已有大量文献证明适量水杨酸(SA)可以促进种子萌发且能起到缓解环境胁迫的作用[15, 16, 24, 25]。当植物处于干旱或盐胁迫时, 水分亏缺和离子毒害会导致活性氧等有害物质大量生成, 细胞膜脂过氧化程度加剧和电解质泄漏等不良生理反应, 此时植物需要通过渗透调节系统和抗氧化物质, 来进行抗氧化防御, 防止过度失水, 清除活性氧物质, 保持生物膜的完整性[26, 27]。SA能调节可溶性蛋白含量, 降低膜的渗透性, 提高抗氧化酶和非酶类抗氧化系统的活性, 从而提高渗透势, 限制Na+的内流, 减少活性氧数量和缓解细胞的损伤程度[25, 28]。在本研究中, 采用SA浸种处理的两种黄芪种子发芽率均显著优于拌种处理(P< 0.05)。浸种处理能在种子获取SA的同时进行吸胀作用获取水分用以支持胁迫下种子的萌发; 而拌种处理下, 虽然SA一直都存在于溶液中, 但是胁迫产生的抑制作用远大于SA的补偿作用。SA浸种后的两种黄芪种子在PEG下的发芽率要高于NaCl下的发芽率, 说明SA与PEG和NaCl存在不同的化学反应。此外, 膜荚黄芪种子的发芽率在PEG和NaCl下对SA的浓度差异没有明显的反应; 而蒙古黄芪种子的发芽率在PEG下随着SA浓度的增加而减少, 在NaCl下却随着SA浓度的增加有小幅上升。SA的抗性机制是通过结合其他植物激素参与的复杂信号转导网络实现的, 不同浓度的SA在不同环境条件下对不同植物品种或器官的作用存在巨大差异[29, 30]。SA也可以通过拮抗作用对植物达到保护效果[31]。PEG只具有渗透胁迫效果, 而NaCl兼具渗透胁迫和离子效应[32], 因此是否由于种子自身含有的化学物质能与SA和NaCl发生反应, 从而导致在不同浓度SA、PEG和NaCl下蒙古黄芪种子截然不同的萌发表现这一猜测还需要进一步研究。

综上所述, 虽然渗透胁迫和离子毒害对于种子的生长发育属于逆境胁迫[33, 34], 但是轻度PEG和NaCl胁迫可以在一定程度上促进膜荚黄芪种子萌发。蒙古黄芪由于适生生境的影响, 其种子对干旱和盐胁迫的耐受能力要强于膜荚黄芪种子。此外, 膜荚黄芪种子和蒙古黄芪种子应对SA处理产生差异化表现的深层次原因还需更进一步的研究。

(责任编辑 张瑾)

The authors have declared that no competing interests exist.

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