苜蓿素(≥ 98%, 色谱纯), 从燕麦中提取, 购于上海源叶生物科技有限公司; 脂多糖(LPS, 血清型O55:B5)购于美国Sigma公司; 试验所用奶牛乳腺上皮细胞与占今舜等^[16]相同。

1.2.1 细胞活性检测 试验于2016年9月开始进行, 试验分为4组, 即基础培养基(对照组)、基础培养基中加入1 μ g· mL^-1的LPS(L)、基础培养基中加入1 μ g· mL^-1的LPS和10 μ g· mL^-1苜蓿素(L+T)和基础培养基中加入10 μ g· mL^-1苜蓿素(T), 每组5个重复, 其中苜蓿素用二甲基亚砜(DMSO)(索莱宝, 北京)完全溶解, 4个处理组中的DMSO含量低于2‰ 。细胞活性采用CCK-8法进行检测, 试验方法参照Matsui等^[17]。

1.2.2 抗氧化指标的测定 取密度为5× 10⁵个· mL^-1细胞接种到六孔板, 方法同上。一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等指标的测定方法参照占今舜等^[16]。

1.2.3 细胞总RNA的提取和RT-PCR条件 取密度为5× 10⁵ mL^-1细胞接种到6孔板, 方法同上。试验结束时, 进行RNA提取和cDNA的合成。提取和合成方法参照占今舜等^[18]。RT-PCR试剂盒由Roche公司提供, PCR反应液配制在冰上进行, 反应液包括Master Mix 10 μ L, 上下游引物各1 μ L, PCR级水3 μ L, cDNA 5 μ L。将配制的反应液加入96孔反应板(Roche公司提供)中, 在Light Cycler^􀳏 96 PCR仪(Roche公司)上进行PCR检测。PCR反应程序:95 ℃预变性600 s; PCR反应为95 ℃、10 s, 退火60 ℃和72 ℃延伸各10 s, 循环45次; 融解曲线分析65 ℃、60 s。

1.2.4 引物设计 根据Gene Bank中的基因序列, 引物设计采用Primer 5.0软件完成, 引物合成则由Invitrogen公司完成。引物序列如表1和2所列。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 炎症因子相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences for inflammatory genes 基因 Gene 登录号 Accession number 引物序列(5'-3') Primer sequence 产物长度 Product length/bp GAPDH NM_001034034 F: GGGTCATCATCTCTGCACCT R: GGTCATAAGTCCCTCCACGA 176 IL-6 NM_173923.2 F: TCCTTGCTGCTTTCACACTC R: CACCCCAGGCAGACTACTTC 129 IL-1β NM_174093.1 F: CAGTGCCTACGCACATGTCT R: AGAGGAGGTGGAGAGCCTTC 209 TNF-α NM_177512.2 F: GCCCTCTGGTTCAGACACTC R: AGATGAGGTAAAGCCCGTCA 192 TLR2 NM_174197.2 F: CAGGCTTCTTCTCTGTCTTGT R:CTGTTGCCGACATAGGTGATA 140 TLR4 NM_174198.6 F: GACCCTTGCGTACAGGTTGT R: GGTCCAGCATCTTGGTTGAT 103 MyD88 NM_001014382.2 F: TCATTGAGAAGAGGTGCCGT R:TGGCTTGTACTTGATGGGGAT 146

表1 炎症因子相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences for inflammatory genes

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 乳蛋白合成相关基因的引物序列 Table 2 Primer sequences for lacto-protein genes 基因 Gene 登录号 Accession number 引物序列(5'-3') Primer sequence 产物长度 Product length/bp LAT1 NM_001135792.1 F:GCGACGTTTGATGAGCTGAT R:TGTTGACCATGGCTGACTCT 172 CAT1 NM_174613.2 F:CTCCCAAAACAGCATCCACC R:CACCCAAGAAAACTGAGGCC 171 mTOR XM_002694043.3 F:TGTGGAGTTTGAGGTGAAGC F:ATTATCAAAGAAGGGCTGCAC 148 S6K1 NM_205816.1 F:ATGAAAGCATGGACCATGGG R:CCGGTATTTGCTCCTGTTAC 199 4EBP1 NM_1077893.2 F:GAACTCACCTGTGACCAAGA R:CTCAAACTGTGACTCTTCACC 157 JAK2 XM_005209981 F:TGAAGACCGAGACCCTACAC R:CTGCAAGGATTTAAGGATTTC 211 STAT5 NM_001012673.1 F:TTCAGCGACTCAGAAATTGG R:GGTCGGGAAACACGTAGATG 163

表2 乳蛋白合成相关基因的引物序列 Table 2 Primer sequences for lacto-protein genes

试验数据先用Excle 2007进行预处理, 基因表达量采用2^{-Δ Δ Ct}方法进行计算。数据采用(平均值± 标准误)表示, 并在IBM SPSS Statistics 21.0软件上进行ANOVA分析, LSD法进行多重比较。

结果表明, 苜蓿素具有促进细胞增殖的作用。只加入苜蓿素的T组的奶牛乳腺上皮细胞相对活性显著高于其他各组(P< 0.01); 奶牛乳腺上皮细胞活性在脂多糖(L)刺激下显著降低(P< 0.05), 而添加苜蓿素(L+T)较脂多糖处理能够显著提高细胞活性(P< 0.05)(图1)。

图1

Fig. 1

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图1 苜蓿素对脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮细胞活性的影响 不同小写字母表示差异显著(P< 0.05), 不同大写字母表示差异极显著(P< 0.01), 相同字母表示差异不显著(P> 0.05)。Control, 对照, 表示基础培养基, L表示基础培养基中加入1 μ g· mL-1 LPS, L+T表示基础培养基中加入1 μ g· mL-1 LPS+10 μ g· mL-1 苜蓿素, T表示基础培养基中加入10 μ g· mL-1 苜蓿素, 下同。Fig. 1 Effect of tricin on viability of LPS-induced BMECs Different lowercase and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively, and the same letter indicate no significant difference at the 0.05 level. Control, basic medium; L, basic medium with 1 μ g· mL-1 LPS; L+T, basic medium with 1 μ g· mL-1 LPS+10 μ g· mL-1 tricin; T, basic medium with 10 μ g· mL-1 tricin; similarly for the following tables.

在LPS刺激下, 乳腺上皮细胞LDH活性和NO、MDA含量极显著升高(P< 0.01), SOD活性极显著降低(P< 0.01); 而添加苜蓿素后, NO和MDA含量较L处理显著降低(P< 0.01), SOD活性显著升高(P< 0.01)(表3)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 苜蓿素对脂多糖刺激下乳腺上皮细胞抗氧化指标的影响 Table 3 Effect of tricin on antioxidant indices of mammary epithelial cells treated with LPS 项目 Item 处理Treatment 对照Control L L+T T 超氧化物歧化酶 SOD/(U· mL-1) 15.85± 0.14A 11.39± 0.12C 13.70± 0.14B 16.16± 0.18A 乳酸脱氢酶LDH/(U· L-1) 343.42± 13.02Bb 392.16± 11.92Aa 389.68± 9.91Aab 358.65± 9.77ABb 一氧化氮NO/(μ mol· L-1) 21.12± 1.15Bc 82.30± 2.65Aa 39.13± 3.73Bb 31.37± 8.48Bbc 丙二醛MDA/(nmol· L-1) 3.14± 0.07B 6.49± 0.09A 2.35± 0.21C 1.55± 0.01D Different lowercase and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively, and the same letter indicate no significant difference at the 0.05 level. Control, basic medium; L, basic medium with 1 μ g· mL-1 LPS; L+T, basic medium with 1 μ g· mL-1 LPS+10 μ g· mL-1 tricin; T, basic medium with 10 μ g· mL-1 tricin; this also applies to Table 4 and Table 5. 同行不同小写字母表示差异显著(P< 0.05), 不同大写字母表示差异极显著(P< 0.01), 相同字母表示差异不显著(P> 0.05)。Control, 对照, 表示基础培养基, L表示基础培养基中加入1 μ g· mL-1 LPS, L+T表示基础培养基中加入1 μ g· mL-1 LPS+10 μ g· mL-1 苜蓿素, T表示基础培养基中加入10 μ g· mL-1 苜蓿素。表4、表5同。

表3 苜蓿素对脂多糖刺激下乳腺上皮细胞抗氧化指标的影响 Table 3 Effect of tricin on antioxidant indices of mammary epithelial cells treated with LPS

与对照组相比, 添加苜蓿素能够极显著升高细胞MyD88的表达(P< 0.01)(表4)。在LPS刺激下, 细胞IL-1β 、IL-6、TNF-α 、TLR2、TLR4和MyD88的表达均显著升高(P< 0.01), 而较LPS处理添加苜蓿素能够显著降低IL-1β 、TNF-α 、TLR2和TLR4的表达(P< 0.01)。以上结果表明, 苜蓿素能够抑制LPS诱导下细胞炎症因子的产生。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 苜蓿素对脂多糖刺激下乳腺上皮细胞炎症因子基因表达的影响 Table 4 Effect of tricin on inflammatory gene expression of mammary epithelial cells treated with LPS 基因 Gene 处理Treatment 对照Control L L+T T IL-1β 1.00± 0.01C 356.84± 26.62A 280.21± 7.49B 1.34± 0.10C IL-6 1.00± 0.00B 14.39± 0.95A 13.63± 1.39A 1.04± 0.09B TNF-α 1.00± 0.01C 16.07± 0.66A 11.26± 0.59B 0.84± 0.06C TLR2 1.01± 0.09C 11.69± 0.33A 6.61± 0.30B 1.77± 0.40C TLR4 1.02± 0.10B 3.04± 0.24A 1.72± 0.44B 1.31± 0.07B MyD88 1.01± 0.06Bc 2.13± 0.20Aa 1.79± 0.18Aab 1.57± 0.40Ab

表4 苜蓿素对脂多糖刺激下乳腺上皮细胞炎症因子基因表达的影响 Table 4 Effect of tricin on inflammatory gene expression of mammary epithelial cells treated with LPS

无LPS刺激下, 添加苜蓿素能够极显著提高细胞JAK2、STAT5、mTOR、4EBP1和S6K1的表达量(P< 0.01), 但降低了CAT1的表达(P< 0.01), LAT1无明显变化(表5)。在LPS刺激下, 细胞CAT1、LAT1、STAT5、mTOR和4EBP1的表达显著降低(P< 0.01或P< 0.05), 而添加苜蓿素能够显著升高STAT5的表达(P< 0.01)和降低CAT1的表达(P< 0.01)。结果说明, 添加苜蓿素能够促进乳蛋白的合成; LPS刺激下, 乳蛋白合成受阻, 而添加苜蓿素对乳蛋白合成影响不明显。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 苜蓿素对脂多糖刺激下乳腺上皮细胞内信号通路及乳蛋白合成相关基因表达的影响 Table 5 Effect of tricin on signal path and lactoprotein synthesis of mammary epithelial cells treated with LPS 基因 Gene 处理Treatment 对照Control L L+T T CAT1 1.00± 0.00Aa 0.57± 0.05BCc 0.43± 0.04Cd 0.73± 0.05Bb LAT1 1.00± 0.02A 0.35± 0.04B 0.38± 0.02B 1.05± 0.05A JAK2 1.00± 0.02B 0.93± 0.02B 0.94± 0.07B 2.44± 0.11A STAT5 1.00± 0.04B 0.29± 0.01D 0.63± 0.004C 1.45± 0.12A mTOR 1.01± 0.08Bb 0.56± 0.02Bc 0.55± 0.02Bc 2.04± 0.22Aa 4EBP1 1.00± 0.04B 0.50± 0.03C 0.46± 0.03C 1.67± 0.16A S6K1 1.00± 0.08B 0.91± 0.02B 1.10± 0.07B 1.98± 0.21A

表5 苜蓿素对脂多糖刺激下乳腺上皮细胞内信号通路及乳蛋白合成相关基因表达的影响 Table 5 Effect of tricin on signal path and lactoprotein synthesis of mammary epithelial cells treated with LPS

一般情况下, 体内自由基的产生和清除处于动态平衡。体内产生的自由基过多, 会导致细胞中的不饱和脂肪酸产生MDA, 进而致使细胞解体, 促使细胞死亡^[19]。Shi等^[12]研究发现, LPS能够导致奶牛乳腺上皮细胞的GSH-Px、SOD和CAT活性降低, 而MDA含量升高。刘立新等^[20]和王亨等^[21]研究发现, LPS能够抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。而本研究也发现, LPS降低细胞的成活率和抗氧化能力。以上结果说明, 脂多糖可能会增加细胞内自由基, 导致细胞损伤, 进而抑制细胞增殖。通过体外细胞培养技术研究发现, 添加适量的苜蓿黄酮、大豆黄酮和染料木黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞的活性和SOD活性, 降低MDA的含量^{[22, 23]}。说明黄酮类物质可以通过提高细胞的抗氧化能力, 促进细胞的增殖。从本研究结果看, 苜蓿素能够发挥抗氧作用, 抑制LPS诱导下细胞的增殖。

LDH是糖酵解过程中的一种氧化还原类酶, 能够催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应。只有当细胞受到损伤时, LDH活性会升高。研究发现, 苜蓿黄酮能够降低热应激下奶牛乳腺上皮细胞的LDH的活性^[16]; 二羟异黄酮和三羟异黄酮能够降低过氧化氢诱导的中国仓鼠卵巢细胞的 LDH释放量^[24]。结果说明, 黄酮类化合物能够降低LDH的活性。本研究结果与上述研究相似, 说明LPS能够造成细胞损伤, 导致细胞LDH活性升高, 而添加苜蓿素能够降低LDH活性, 进而保护细胞免受损伤。LPS是一种重要的炎症反应因子, 能够诱导TNF-ɑ 、IL-1β 、IL-6等细胞因子参与炎症反应。NO是细胞内和细胞间的重要信号分子, 具有调节上皮细胞正常功能等作用, 且在炎症反应中发挥着重要作用。当细胞和组织发生炎症时, 会促进诱导型一氧化氮酶(iNOS)的表达, 使NO含量升高, 进而激活环氧化酶2(COX-2), 诱导细胞凋亡^{[25, 26]}。Jung等^[27]研究发现, 苜蓿素能够通过调节NF-κ B和STAT3下调iNOS和COX-2的表达, 进而抑制LPS诱导下RAW264.7 细胞内的NO和ROS含量。Shalini等^{[28, 29, 30]}研究发现, 苜蓿素能够显著下调LPS刺激下人外周血单核细胞(hPBMCs)TNF-α 、IL-6、PGE2 和 NO的生成, 抑制 TLR4、MyD88 和TRIF 蛋白的活性; 通过调节MAPK和PI3K/Akt 通路, 下调NF-κ B信号, 降低COX-2 和TNF-α , 提高人脐静脉血管内皮细胞的抗炎症作用。另外, 苜蓿素能够显著降低哮喘小鼠TNF-α 、IL-1β 和 NO水平, 显著降低肺泡巨噬细胞的TLR4、MyD88 和NF-κ B p65 mRNA和蛋白相对表达量^[31]。本研究也发现, 苜蓿素能够显著降低LPS诱导性奶牛乳腺上皮细胞TNF-α 、IL-6、IL-1β 、TLR4、TLR2的表达和 NO水平, 说明苜蓿素发挥抗炎症作用与其调控TRL4/MyD88/NF-κ B 通路有关。

乳蛋白是血液中游离氨基酸在乳腺上皮细胞中合成, 而氨基酸进入细胞需要氨基酸转运载体的参与。碱性氨基酸主要由氨基酸转运载体CAT1进行转运, 而支链氨基酸、中性氨基酸和一些必需氨基酸则由LAT1转运, 因此, 这两种氨基酸转运载体表达的高低能够影响乳蛋白的合成。从本研究来看, 在LPS刺激下, 无论是否添加苜蓿素, 均抑制氨基酸的转运。将小鼠的JAK2和STAT5基因敲除, 发现小鼠的乳腺腺泡发育不良, 乳蛋白含量降低, 酪氨酸磷酸化作用降低。激活的mTOR能够抑制4EBP1发生磷酸化, 促使eIF4E释放4EBP1, 进而促进蛋白质的翻译。mTOR还能够促进S6K1磷酸化, 增强含嘧啶基因mRNA的翻译, 进而调节蛋白质的合成^{[18, 32]}。因此, 乳蛋白的合成受到JAK2-STAT5和mTOR信号通路的调控。刘立新等^[33]研究发现, 在LPS(> 1 μ g· mL^-1)刺激下, 奶牛乳腺上皮细胞的mTOR、S6K1、4EBP1 和STAT5 mRNA转录和相关蛋白的表达降低。本研究结果与其相似。然而张养东^[14]发现, 在LPS(0.1~1 ng· mL^-1)刺激下, 奶牛乳腺上皮细胞S6K1和4EBP1 mRNA的表达提高(P> 0.05), STAT5 mRNA 表达水平显著提高(P< 0.05), 而mTOR和JAK2 mRNA 的表达水平无变化。结果有所不同, 可能是LPS添加剂量不同所致。在本研究中, 在LPS刺激下, 添加苜蓿素对mTOR、JAK2、S6K1和4EBP1的表达无显著影响; 而无LPS刺激下, 添加苜蓿素能显著上调mTOR、JAK2、STAT5、S6K1和4EBP1的表达。结果说明, 苜蓿素可能会通过调控JAK2-STAT5和mTOR信号通路来促进乳蛋白的合成; LPS刺激下, 乳蛋白合成会受阻, 而添加苜蓿素对其影响不大。