1.1.1 敏感品系 苜蓿苔螨种群采自甘肃省马莲河流域水土保持试验站的紫花苜蓿种子田上, 未使用任何农药。采集的苜蓿苔螨> 1 000头, 在人工气候室内用3~5枚叶片的豇豆(Vigna unguiculata)苗饲养。具体方法:在10 cm培养皿中铺厚约1 cm、直径约9 cm的海绵圆片, 其上放置直径10 cm的滤纸后, 在培养皿内加蒸馏水使海绵充分吸收。将豇豆的叶片放置于培养皿的滤纸上, 叶片周围用蒸馏水湿润后的脱脂棉条围住, 为叶片保湿并避免叶螨逃脱。苜蓿苔螨隔离饲养达到30代以上, 视为敏感品系。在饲养条件为温度26 ℃、湿度50%~60%、光周期16 L:8 D的人工气候室饲养。

1.1.2 抗性品系 从敏感品系中分出部分苜蓿苔螨, 开始培育抗药性品系。供试药剂用1.8%阿维菌素EC(abamectin, 江苏富田农化有限公司), 用手持喷雾器喷药, 喷雾处理以叶面湿润但不流失为度; 待种群密度足够大时用阿维菌素进行处理, 以杀死种群70%左右个体的浓度为选择压。在带有敏感品系叶螨的豇豆苗上喷药24 h后, 将豇豆苗上存活的苜蓿苔螨个体转移到新的豆苗上后统计死亡率; 然后待豇豆苗上存活的苜蓿苔螨产卵1~ 2 d后移走, 待同一代卵发育为成熟的苜蓿苔螨后, 再一次喷药。

1.1.3 毒力测定 采用Food and Agriculture Organization of the United (FAO)推荐的玻片浸渍法进行苜蓿苔螨的毒力测定^[14]。设置5个浓度, 且使苜蓿苔螨的死亡率维持在20%~80%。将浸过药的载螨玻片平放在方盘中的滤纸上, 置于温度26 ℃、湿度50%~60%、光周期16 L:8 D的的培养箱内, 24 h后镜检死亡率。生物测定时所选均为3~5 d龄的健康雌成螨, 浸药5 s后立即用吸水纸迅速吸干附着在胶带表面和螨体上的药液。在整个抗性培育过程中, 测定苜蓿苔螨抗性品系对阿维菌素LC₅₀, 毒力在选育过程中测定5次以上, 并计算其LC₅₀。

以抗药性指数(R_f) 表示抗性程度:R_f=(F_n代LC₅₀)/(F₀代LC₅₀), 式中, F_n表示苜蓿苔螨的抗性品系汰选至n代, F₀表示苜蓿苔螨抗性品系汰选的起始代。

移栽一株3~5片叶的豇豆苗在营养钵内, 在豇豆苗上的单叶上移接1头雌成螨, 产卵后即剔去雌成螨。待豇豆单叶上卵的孵化后, 仅保留1头幼螨, 剔去其余的幼螨和卵; 叶片基部缠绕湿脱脂棉条防止叶螨逃逸并保湿。将营养钵放置于瓷盘内并外套纱罩, 置于温度26 ℃、湿度50%~60%、光周期16 L:8 D的气候室内, 叶螨饲养期间停止用药。抗性品系和敏感品系各饲养80~100头。每天记载单头叶螨的发育情况, 并记录每雌每日的产卵数, 直至死亡。

根据Roush和Plapp^[15]的方法组建苜蓿苔螨的试验种群生命表, 计算敏感品系、抗性品系在26 ℃下的种群生命参数, 内禀增长率(r_m)、净生殖率(R₀)、周限增长率(λ )、世代平均历期(T)、种群加倍时间(p.b.t)用以下公式分别计算得出^{[8, 16, 17]}:

r_m=ln R₀/T;

R₀=∑ L_X m_X;

λ =e^rm;

T=∑ L_X m_X X/R₀;

p.b.t=ln2/r_m.

式中:X为时间(d), L_X为叶螨在X时间的存活率, m_X为叶螨在X-1到X时间内的每雌产仔量; 以r_m和R₀评价相对适合度。另外, 不同品系各螨态发育历期缩短率=(S品系各螨态发育历期-R品系各螨态发育历期)/S品系各螨态发育历期× 100%。

苜蓿苔螨对阿维菌素的抗药性发展较快, 筛选到20代, 抗药性倍数的增长为17.14。抗药性上升较快的两个阶段分别为F₅-F₁₅和F₁₅-F₂₀, 抗性系数分别上升6.58和9.01(表1)。从筛选各代毒力方程的b值来看, 苜蓿苔螨对阿维菌素的抗药性形成了明显的两个阶段:第1阶段是F₀-F₁₀, b值由2.301 1逐渐降低为0.715 4, 表明在抗性品系中出现了抗性杂合子, 并不断增多, 抗药群体的异质性变大; 第2阶段是F₁₀-F₂₀, b值又由0.715 4逐渐增大为3.379 5, 表明抗性品系中的抗性杂合子进化为抗性纯合子并不断增多, 说明抗药群体的异质性越来越小。从本次选育中最后两次测定的R_f值及b值进行分析, 由于两次测定F₁₈和F₂₀的R_f值分别为14.67和17.41, b值分别为2.783 2和3.329 5, 二者之间相差不大。因此, 本试验将苜蓿苔螨的抗性品系选育至20代。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 抗阿维菌素苜蓿苔螨品系的选育 Table 1 The selection of resistance to avermectin in B. praetiosa 筛选代数 Selected generation 毒力方程(y=a+bx) LC-P line 致死中浓度(95%置信限) LC50 (95% CL)/(mg· L-1) 卡方值 Chi square value(χ 2) 抗性系数 Fold of increase in resistance F0 y=7.198 7+2.301 1x 0.058 3 (0.046 3~0.082 2) 1.711 8 1.00 F5 y=8.215 4+1.534 6x 0.090 4 (0.064 5~0.125 1) 2.297 1 1.55 F10 y=6.981 1+0.715 4x 0.302 5 (0.180 1~0.567 2) 1.913 3 5.19 F15 y=5.291 8+1.587 1x 0.474 1 (0.265 3~0.659 4) 2.520 9 8.13 F18 y=5.918 3+2.783 2x 0.855 3 (0.649 5~1.146 6) 1.811 7 14.67 F20 y=7.115 6+3.329 5x 0.998 7 (0.725 3~1.310 7) 2.560 1 17.14

表1 抗阿维菌素苜蓿苔螨品系的选育 Table 1 The selection of resistance to avermectin in B. praetiosa

与敏感品系相比, 苜蓿苔螨抗品系发育历期的测定结果表明, 除卵期外, 幼螨期、前若螨期、后若螨期、产卵前期和产卵期的发育历期均显著缩短(P< 0.05), 5个螨态的发育历期缩短的幅度分别依次为23.11%、16.16%、14.77%、21.82%和19.40%; 苜蓿苔螨的平均寿命缩短了28.10%(表2)。

与敏感品系比较, 苜蓿苔螨抗性品系平均每雌每天产卵量和平均每雌产卵量均显著减少(P< 0.05), 分别减少了33.99%和31.14%(表3); 抗性品系的产卵期也缩短了19.40%(表2)。另外, 苜蓿苔螨抗性品系雌螨所产卵的孵化率也显著低于敏感品系的卵孵化率 (P< 0.05)(表3)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 苜蓿苔螨抗性品系(R)和敏感品系(S)的各螨态发育历期比较 Table 2 Developmental duration of the avermectin-resistant strain(R) and the susceptible strain(S) of B. praetiosa 发育期 Development stage 发育历期Developmental duration/d 减少率 Percent reduction/% 敏感品系 Susceptible strain 抗性品系 Resistant strain 卵期Egg 8.37± 0.25a 7.59± 0.26a 9.32 幼螨期Larva 4.89± 0.31a 3.76± 0.41b 23.11 前若螨期Pre-nymph 3.28± 0.57a 2.75± 0.69b 16.16 后若螨期Lat-nymph 4.47± 0.51a 3.81± 0.46b 14.77 产卵前期Pre-oviposition 1.65± 0.61a 1.29± 0.42b 21.82 产卵期Oviposition 9.38± 3.05a 7.56± 2.31b 19.40 平均寿命Longevity 27.94± 4.61a 20.09± 5.35b 28.10 The data in the table are mean± SE. Different letters within the same row indicate significant difference between susceptible and lesistant strains by Duncan’ s multiple range test at the 0.05 level; similarly for the following tables. 表中数据为平均值± 标准误。同行不同字母表示经Duncan法多重比较两个品系间差异显著(P< 0.05)。下同。

表2 苜蓿苔螨抗性品系(R)和敏感品系(S)的各螨态发育历期比较 Table 2 Developmental duration of the avermectin-resistant strain(R) and the susceptible strain(S) of B. praetiosa

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 苜蓿苔螨抗阿维菌素品系和敏感品系的繁殖力 Table 3 Fecundity of the avermectin-resistant strain and susceptible strain of B. praetiosaa 指标Parameter 敏感品系Susceptible strain 抗性品系Resistant strain 平均每雌日均产卵量Fecundity per female per day/egg 2.53± 0.85a 1.67± 0.54b 平均每雌产卵量Fecundity per female/egg 40.91± 9.75a 28.17± 8.36b 卵孵化率Hatchability/% 83.97± 3.47a 65.41± 2.83b

表3 苜蓿苔螨抗阿维菌素品系和敏感品系的繁殖力 Table 3 Fecundity of the avermectin-resistant strain and susceptible strain of B. praetiosaa

反映苜蓿苔螨生长发育和繁殖能力的内禀增长率(r_m)、净生殖率(R₀)、周限增长率(λ )、世代历期(T)和种群加倍时间(p.b.t)等指标, 在苜蓿苔螨抗性品系与敏感品系间均存在显著差异(P< 0.05)(表4)。苜蓿苔螨抗性品系的相对适合度仅为苜蓿苔螨敏感品系的0.49。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 苜蓿苔螨抗性和敏感品系的生命表参数(26 ℃) Table 4 Life table parameter of the avermectin-resistant strain and susceptible strain of B. praetiosa (26 ℃) 指标Parameter 敏感品系Susceptible strain 抗性品系Resistant strain 内禀增长率Innate capacity of increase 0.2316a 0.1978b 世代历期Developmental duration 15.83a 13.11b 周限增长率Finite rate of increase 1.278 3a 1.159 2b 种群加倍时间Population doubling time 3.869 0a 2.978 8b 净生殖率Net repro-ductive rate/% 88.048 3a 43.698 8b 相对适合度Relative fitness 1.00 0.49

表4 苜蓿苔螨抗性和敏感品系的生命表参数(26 ℃) Table 4 Life table parameter of the avermectin-resistant strain and susceptible strain of B. praetiosa (26 ℃)

阿维菌素处理昆虫后, 对昆虫不同发育阶段的发育历期、产卵能力等生命参数有明显的影响^{[17, 18, 19]}。宋子伟等^[20]通过室内评价阿维菌素亚致死剂量对虚伪新小绥螨成螨生长发育及生殖的影响发现, 阿维菌素亚致死剂量对发育历期影响主要表现为产卵前期的延长, 产卵期和产卵后期缩短, 但对整体平均寿命影响不显著。本研究表明, 苜蓿苔螨对阿维菌素产生抗性后, 除卵期外, 幼螨期、前若螨期、后若螨期、产卵前期和产卵期的发育历期与敏感品系比较均显著缩短, 抗性品系的平均寿命也显著短于敏感品系。另外, 苜蓿苔螨抗药性种群的发育速率加快, 抗药性种群的世代重叠严重, 说明阿维菌素有刺激苜蓿苔螨发育的效应, 本研究结果与前人^{[13, 16]}的研究结果一致。

通过对苜蓿苔螨抗性品系与敏感品系的生殖力比较发现, 抗性品系的产卵量降低、产卵期缩短, 抗性品系的生殖力显著低于敏感品系, 提示苜蓿苔螨抗性品系在生殖上存在着不利性。本研究结果与多位学者对抗药性叶螨和昆虫生殖力报道一致^{[16, 17, 18, 19]}。宋子伟等^[20]研究发现, 亚致死剂量的阿维菌素处理虚伪新小绥螨后, 其内禀增长率和净增殖率下降, 而种群加倍时间和平均世代周期增长。另外, 高宗仁等^[12]研究也表明, 杀虫剂对抗性朱砂叶螨种群有刺激增殖的作用。本研究认为, 抗性种群的生殖力可能与害螨(害虫)种类、杀虫剂种类、抗药性的高低及其抗性机理等有关系, 进一步深入研究抗性种群的生殖力及其作用机理有助于指导害螨(害虫)的综合治理。

相对适合度是以基因为基础的害螨(害虫)对环境胁迫(如杀虫剂等)的应答、繁殖和生长发育的适应能力大小, 并决定了害螨(害虫)在杀虫剂的选择压力下的适应行为^{[16, 19]}。抗药性害螨(害虫)在没有杀虫剂的选择压力下, 其抗性基因在杀虫剂的汰选中存在不利性^[17]。韩文素等^[21]报道, 小菜蛾阿维菌素的抗性种群相对于敏感种群表现为一定的生殖劣势。一般来说, 昆虫或蜱螨抗药性的产生, 除了与体内相关酶系有关外, 与药剂对其生殖力的影响密切相关。对抗药性品系与敏感品系的相对适合度比较, 抗性品系的生殖力较低, 即抗性种群的等位基因常与生殖的不利性有密切的关系^[22]。但不同学者对相对适合度的评价指标方面存在着分歧, Roush和Plapp^[15]评价抗性品系的生育力时发现, 平均发育历期的重要性高于生殖力, 认为发育历期对抗性品系的繁殖力影响大。唐振华等^[23]认为, 净生殖率和世代历期都是相对适合度的重要指标, 二者均不能忽视。本研究也表明, 苜蓿苔螨抗性品系与敏感品系之间的净生殖率(R₀)和世代历期(T)存在着显著的差异, 但内禀增长率(r_m)的差异不显著。因此, 以净生殖率作为评价抗性种群的生物适合度指标, 更能反映抗性品系在杀虫剂等胁迫下害螨(害虫)的繁殖力和生存能力大小。本研究表明, 苜蓿苔螨抗性品系存在着生长发育和繁殖的缺陷, 这有助于解释苜蓿苔螨抗阿维菌素品系存在生物适合度不利的现象, 并为苜蓿苔螨抗性治理提供参考。