试验用紫花苜蓿种子为龙牧801(Longmu 801), 由东北农业大学动物科学技术学院草业科学实验室提供。

选取籽粒饱满、健康的紫花苜蓿种子, 用5%的次氯酸钠消毒10 min, 蒸馏水冲洗4~5次后置于铺有滤纸的培养皿中, 放入人工培养箱中暗培养, 相对湿度60%~75%, 培养温度25 ℃/20 ℃(日/夜), 待苜蓿子叶展开后转入自制的苜蓿培养槽中, 用改良的Hoagland营养液水培^[14], 每2 d换一次培养液。二周龄的紫花苜蓿幼苗转入NaCl浓度为0、0.2%、0.4%、0.8%的营养液中进行盐胁迫处理, 处理时间分别为0、1、2、4、8 h, 取整株幼苗为试验材料, 样品立即进入液氮中冷冻处理并储存在-80 ℃冰箱中直至使用。每个处理设4个生物学重复。

紫花苜蓿幼苗总RNA用TIANGEN的RNAprep Pure 植物总RNA提取试剂盒提取, 用1%琼脂糖凝胶检测其完整性(图1a), 用微量分光光度计进行浓度的测定。RNA的反转录用的HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 试剂盒(Vazyme, 中国)进行, cDNA质量用Taq酶(Vazyme, 中国)进行普通PCR鉴定(图1b)。

图1

Fig. 1

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	图1 紫花苜蓿幼苗总RNA 电泳图和cDNA 质量评估图Fig. 1 Electrophoregram of total RNA and quality evaluation of cDNA of alfalfa seedlings M, marker DL 2 000.

盐响应相关基因的选择以前期获得的紫花苜蓿盐胁迫下差异表达蛋白质组数据为基础^[4], 通过生物信息分析差异蛋白的分子功能、参与的生物过程和代谢通路, 然后筛选出9个盐响应相关蛋白, 并在NCBI中Blast其对应基因的编码序列和登录号, 获得盐响应相关基因(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 9个盐响应相关基因的KEGG通路注释 Table 1 KEGG path annotation of nine salt-tolerance genes 基因 Gene 描述 Desription KEGG通路 KEGG path ID 通路 Pathway G6PI 葡糖胺-6-磷酸异构酶/6-磷酸葡糖酸内酯酶 glucosamine-6-phosphate isomerase/ 6-phosphogluconolactonase K01057 戊糖磷酸途径Pentose phosphate pathway 代谢途径Metabolic pathways 次生代谢物的生物合成 Biosynthesis of secondary metabolites 碳代谢Carbon metabolism ABP19a 生长素结合蛋白ABP19a auxin-binding protein ABP19a - - Trx-h1 硫氧还蛋白H型 thioredoxin H-type 1 protein K03671 ko04621 NOD受体信号通路 ko04621 NOD-like receptor signaling pathway PR bet 1 病程相关蛋白pathogenesis-related protein bet V I family protein - - GDPD 甘油磷酸二酯磷酸二酯酶家族蛋白 glycerophosphoryl diester phosphodiesterase family protein K01126 ko00564 甘油脂代谢 ko00564 glycerophospholipid metabolism FBPA 果糖-二磷酸醛缩酶 fructose-bisphosphate aldolase K01623 糖酵解/糖异生Glycolysis/Gluconeogenesis 戊糖磷酸途径Pentose phosphate pathway 果糖与甘露糖代谢 Fructose and mannose metabolism 光合生物的碳固定作用 Carbon fixation in photosynthetic organisms 代谢途径Metabolic pathways 次生代谢物的生物合成 Biosynthesis of secondary metabolites 碳代谢Carbon metabolism 氨基酸生物合成Biosynthesis of amino acids RRM RNA识别基序RNA recognition motif K12900 剪接体spliceosome 6PGDH 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶NAD结合域蛋白 6-phosphogluconate dehydrogenase NAD-binding domain protein K00020 ko00280 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解 Valine, leucine and isoleucine degradation ALDH NAD依赖性醛脱氢酶家族蛋白 NAD-dependent aldehyde dehydrogenase family protein K00130 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 Glycine, serine and threonine metabolism 代谢途径Metabolic pathways

表1 9个盐响应相关基因的KEGG通路注释 Table 1 KEGG path annotation of nine salt-tolerance genes

实时定量PCR以紫花苜蓿肌动蛋白基因β -Actin作为内参, 紫花苜蓿9个盐响应相关基因为目的基因, 采用Premier 5.0进行引物的设计(表2), 荧光定量PCR用ABI7500实时荧光定量PCR仪完成整个试验, 反应体系(20 μ L):10 μ L 2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme-ChamQ SYBR qPCR Master Mix), ROX Reference Dye 2(50 X) 0.4 μ L, cDNA 1 μ L, 终浓度为10 μ mol· L^-1的上下游引物各0.4 μ L, dd H₂O 7.8 μ L。反应结束后, 通过检测溶解曲线来确定PCR产物的特异性, 采用Livak和 Schmittgen^[15]提出的2^{-Δ Δ ct}计算基因在不同处理下的相对表达量。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences used for RT-PCR 基因名称 Gene name 上游引物序列(5'-3') Forward primer sequence 下游引物序列(5'-3') Reverse primer sequence Actin TTTGAGACTTTCAATGTGCCCGCC TAGCATGTGGGAGTGCATAACCCT G6PI GGATGAGAGAGTAGTGCCAAAG GGGAATTGGTACCTTGGAGATG ABP19a GAATTTCCCTTGCGCGTTTAG ACCAGCACAGATTGTTCCTT Trx-h1 GACAGGTGATCGGTGTTCATAC GACCACACCATGAAGCAGTAA PR bet 1 TGGAAGTTCTGCTGTTAGATGG TCTAGTGCATTTGCTAAGGTAGTC GDPD CAATTGTCAAAGGACGGAACAC CTCAGGGACACTCATTGCTAAA FBPA TGGAAGTTGCTGAGAAGGTATG GTGTAACCATGCTAGGCTTGA RRM GGAAGAAGCTACAGTCCATCAC GACTGGTAGGTAGATCGCTTTG 6PGDH GGTATTGCTTTGCCTGGTTTG GAGCCTGAGTACCCAAATTACC ALDH GCACCGAGGAAGAAGCTATT TGCCTTAGTTACACGCTCAC

表2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences used for RT-PCR

用Excel 2003进行数据前期处理, 用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析, 用Origin 8进行绘图。

葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucosamine-6-phosphate isomerase, G6PI)是催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸(Fru6P)的可逆相互转化的细胞内酶。处理时间和浓度对G6PI基因的表达均有明显影响(图2)。NaCl处理1 h时, 各浓度下G6PI基因的表达量均显著上调(P< 0.05)。0.2% NaCl处理下, G6PI基因的表达量呈先升高后降低再升高的波动性变化; 0.4% NaCl处理下, G6PI基因的表达量在4 h 时达到高峰; 0.8% NaCl处理下, G6PI基因的表达量显著高于其他浓度的处理。

图2

Fig. 2

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图2 盐胁迫下G6PI基因的相对表达量 不同大写字母表示同一处理不同浓度间差异显著(P< 0.05), 不同小写字母表示同一浓度不同处理时间间差异显著(P< 0.05), 下同。Fig. 2 Relative expression of G6PI gene under salt stress Different capital letters indicate significant difference for the same treatment among different time at the 0.05 level; Different lowercase letters indicate significant difference in expression at different time at the same concentration at the 0.05 level, similarly for the following figures.

生长素结合蛋白(auxin-binding protein, ABP)是广泛存在于高等植物中的生长素类物质, 对植物生长发育有调节作用。NaCl处理浓度和时间均对ABP19a的表达量有显著影响(P< 0.05)(图3)。NaCl处理1 h时, 0.4% NaCl胁迫下, ABP19a的表达量先显著上调(P< 0.05), 然后逐步下降; NaCl处理2 h时, 0.4%和0.8% NaCl胁迫的紫花苜蓿中ABP19a的表达量显著上调; 0.2% NaCl胁迫下, ABP19a的表达量从4 h开始显著上调(P< 0.05), 8 h时的表达量是其他浓度处理下的6倍。

图3

Fig. 3

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	图3 盐胁迫下ABP19a基因的相对表达量Fig. 3 Relative expression of ABP19a under salt stress

硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)是具有催化活性二硫键的小型普遍存在的蛋白质。NaCl处理浓度和时间对Trx-h1的表达量都有显著影响(P< 0.05)(图4); 处理1 h时, 除0.2% NaCl胁迫外, 其他浓度处理下Trx-h1的表达量均有显著上调(P< 0.05), 且0.4%NaCl胁迫下上调幅度更大; 0.2% NaCl胁迫下Trx-h1基因的表达量随时间无显著变化; 0.8% NaCl胁迫下, Trx-h1基因的表达量先显著上调, 4 h后显著下调。

图4

Fig. 4

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	图4 盐胁迫下Trx-h1基因的相对表达量Fig. 4 Relative expression of Trx-h1 under salt stress

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PR)是植物体在受到真菌、细菌和病毒等病原菌入侵或受到非生物胁迫后产生的一种或几种上调蛋白, 广泛存在于单子叶和双子叶植物中。如图5所示, NaCl胁迫1 h时, 各浓度处理与对照相比均有显著性上调(P< 0.05), 0.4% NaCl胁迫下的PR bet 1家族蛋白基因的表达量最大, 是同一时间点其他浓度处理的4倍; 在0.2% NaCl胁迫下, PR bet 1家族蛋白基因的表达量在NaCl胁迫处理1 h时表达量最大。

图5

Fig. 5

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	图5 盐胁迫下PR bet 1基因的相对表达量Fig. 5 Relative expression of PR bet 1 under salt stress

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphoryl diester phosphodiesterase, GDPD)催化甘油磷酸二酯类物质水解为甘油-3-磷酸(G-3-P)和相对应的醇类。如图6所示, NaCl胁迫处理1 h时, 3个处理浓度较对照都有显著性变化(P< 0.05); 处理4 h后GDPD基因的表达量均显著升高; 不同浓度处理之间, 0.2% NaCl胁迫下GDPD基因的表达量变化最显著; 在时间处理上, 4 h是该基因表达量大幅上调的节点, 8 h该基因表达量都显著上调(P< 0.05)。

图6

Fig. 6

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	图6 盐胁迫下GDPD基因的相对表达量Fig. 6 Relative expression of GDPD under salt stress

果糖-二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase, FBPA)是生物体内碳代谢及糖代谢途径中的关键酶之一。NaCl处理浓度和时间对FBPA基因的表达量均有显著性影响(P< 0.05); 0.2% NaCl胁迫下, FBPA的表达量随时间无显著变化(P> 0.05); 0.4% NaCl胁迫下, FBPA的表达量在2 h最大; 0.8% NaCl胁迫下, FBPA的表达量在2 h显著上调, 在4 h时达到最大, 并显著高于其他处理浓度和处理时间(图7)。

图7

Fig. 7

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	图7 盐胁迫下FBPA基因的相对表达量Fig. 7 Relative expression of FBPA under salt stress

RNA识别基序(RNA recognition motif, RRM), 被称为核糖核蛋白共有序列(RNP-CS)或RNA结合结构域, 在植物基因表达和调控中起关键作用。如图8所示, NaCl处理浓度和时间对RRM基因的表达量都有显著影响(P< 0.05)。0.2% NaCl胁迫下, RRM基因的表达量在胁迫初期有显著上调; 0.4% NaCl胁迫下, RRM基因的表达量在2 h大幅上调, 4 h表达量达到最大; 0.8% NaCl胁迫下, RRM基因的表达量在2 h大幅度上调, 8 h的表达量显著高于其他处理浓度(P< 0.05)。

图8

Fig. 8

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	图8 盐胁迫下RRM基因的相对表达量Fig. 8 Relative expression of RRM under salt stress

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGDH)是戊糖磷酸途径的一个关键的限速酶。如图9所示, NaCl浓度和处理时间对6PGDH基因的表达均有显著影响(P< 0.05); 在NaCl胁迫处理1 h时, 6PGDH基因的表达量均显著增加, 且0.4%的浓度处理较其他2个浓度表达量更高; 而0.8% NaCl胁迫下, PGDH基因的表达量在2 h后显著上调, 在8 h时最大。

图9

Fig. 9

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	图9 盐胁迫下6PGDH基因的相对表达量Fig. 9 Relative expression of 6PGDH under salt stress

醛脱氢酶(NAD-dependent aldehyde dehydrogenase family protein, ALDH)是一类依赖NAD(P)⁺的蛋白酶类。如图10所示, NaCl浓度和处理时间对于ALDH基因的表达均有显著性影响(P< 0.05); 在受到NaCl胁迫时, ALDH的相对表达量在1 h显著提高, 然后逐步下降并在2 h时再次显著上调(P< 0.05)。

图10

Fig. 10

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	图10 盐胁迫下ALDH基因的相对表达量Fig. 10 Relative expression of ALDH under salt stress