以吉林省农业科学院于洪柱等^[8]选育的紫花苜蓿不育系MS-GN-1A为母本, 恢复系MS178为父本配置杂交组合产生F₁代(144株), 在 2014年获得杂交F₁代种子, 2015年将F₁代种子种植于大田中。使用人工方式强迫自交获得F₂代种子, 2016年种植于大田中, 得到F₂代分离群体(221株)。

1.2.1 花粉育性鉴定 在紫花苜蓿开花盛花期, 取父母本、F₁和F₂代群体单株未开放的小穗于冰盒中, 带回实验室。采用花粉染色I2-KI染色法进行染色, 于显微镜下观察花粉育性情况^{[10, 11]}。育性观察统计并计数以后, 并取父母本、F₁和F₂代群体的单株的叶片提取 DNA 用于连锁分析^[12]。

1.2.2 叶片DNA的提取和PCR反应 根据试剂盒说明进行叶片DNA的提取, 将提取后的DNA置于在-20 ℃储存备用。PCR扩增产物用 30%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 进行核酸燃料染色后观察统计并拍照。

1.2.3 多态性标记的筛选 参照F₂育性观察结果分析, 结合田间植株表现^[13], 将所有植株划分为可育和不育两组, 并构建可育和不育DNA混池, 混池DNA从可育和不育植株组DNA中各随机抽取20个样品。

通过已发表的紫花苜蓿遗传图谱中公布的SSR引物 (共8条连锁群296个SSR引物)^[14], 随机选取160条作为初步筛选的引物。通常在 SSR-PCR 反应完成后, PCR 产物会先经过琼脂糖凝胶电泳检测其质量, 并进行多态性条带鉴定, 而后再进行聚丙烯胺凝胶电泳。观察基因池之间的扩增条带是否存在多态性。

初次验证筛选引物后发现含有多态性位点的染色体连锁群, 找到这一条染色体上的所有引物序列。以上引物均根据文献中提供的引物序列^[14], 由上海生工生物技术公司合成引物。

1.2.4 电泳条带统计与重组率计算 在显微镜下观察 F₂群体单株是否可育, 并结合田间形态观察的结果, 确定F₂单株所表现的基因型。将可育单株的基因型标记为“ A” , 不育单株的基因型标记为“ B” 。同时利用具有特异性的SSR引物对F₂单株基因组进行扩增, 对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 并进行核酸染料染色, 对得出的结果进行统计分析。如果扩增出的群体单株目的基因条带与不育基因池相同, 那么将此条带标记为“ B” , 若与可育基因池条带相同, 则标记为“ A” , 如果条带与不育和可育基因池均不相同(杂合型), 则标记为“ H” 。统计条带后做成Excel表格, 再通过遗传作图软件Joinmap 4.0构建遗传图谱, 将3.0作为 LOD 最小值, 最大遗传距离为 50 cM。

淀粉与I2-KI溶液反应, 在显微镜下呈现为深蓝色。可育的花粉粒可以合成淀粉, 显微镜下可以看到深蓝色的花粉颗粒细胞, 反之不育株的花粉不能被染色, 呈现为黄色或浅褐色。有些植株在盛花期的花药中, 并没有花粉颗粒的存在, 所以也就不能被I2-KI染成深蓝色。这说明在植株生长发育至开花期, 一部分植株的花粉粒没有正常合成, 导致花药在发育过程中就发生不正常的改变, 最终形成不育植株^[15]。

于盛花期对大田种植的221株F₂代群体单株花粉颗粒染色后, 显微镜下观察统计出, 不育的F₂代株数为57, 可育F₂代株数164, 并没有观察到半不育植株。

2.2.1 SSR引物的筛选 首先对随机挑选的160对引物(从296对引物中随机选出)进行PCR扩增反应, 结果发现, 所有引物都能扩增出多条条带, 但其中具有特异性的扩增产物有2对。分别是Mt2c12和AW166。图1为 Mt2c12和AW166 的所在位置, 即部分引物的筛选结果, 6号引物Mt2c12和7号引物AW166其扩增产物具有特异的多态性。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 部分引物初步筛选结果 M, 100 bp ladder.图2, 图3同。Fig. 1 Initial screening results of partly screened SSR primers Marker in Figure 2 and Figure 3 is the same as Figure 1.

根据文献[14]中的引物, 将有多态性条带的引物在文章中找到相应的类群Composite5, 将该类群上所有引物进行合成, 现已完成该类群的引物筛选, 结果在两个基因池间发现了5个具有多态性的 SSR 引物, 分别为Mt2c12、AW166、BI68、AW776153和BG267。图2为BI68和BG267所在组中部分引物筛选结果。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 部分引物筛选结果Fig. 2 Screening results of partly screened SSR primers

2.2.2 恢复基因定位 把Mt2c12、BI68、AW776153和BG267分别作为扩增引物, 发现相对应的分别有21、16、32和28株扩增条带与其对应的基因池不同(即为交换), 其他个体的 DNA 扩增条带均与其对应基因池相对应(图3为BG267的部分电泳条带)。将所有数据统计分析输入软件后, 结果如图4所示, 与恢复基因连锁的SSR引物 BI68、Mt2c12、BG267和AW776153, 它们的遗传距离分别为 19.0、20.9、44.6和72.1 cM。并且与恢复基因连锁最为紧密的是引物BI68。

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 SSR引物BG267在基因池和F2可育株的扩增结果 1-18:植株个体编号; Bulk S:不育基因池; Bulk F:可育基因池; S:父本 F:母本。Fig. 3 Results of PCR amplification of BG267 marker gene pools and F2 fertile individuals 1-18: Plant individual number; Bulk S: Sterility gene pool; Bulk F: Fertile gene pool; S: Male parent; F: Female parent.

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因Rf的遗传连锁图Fig. 4 Composite genetic linkage map of 5 primers of cytoplasmic male sterile restorer gene in alfalfa

在筛选引物过程中, 择优选取, 挑选与恢复基因Rf较近的引物, 所以, 在最后遗传作图的时候, 隐去了AW166这个引物。