长叶红砂种子于2015年10月采自内蒙古乌海市青年桥, 经晒干后室温贮藏备用。

植物总RNA提取试剂盒RNA Plant Plus购自北京天根生化科技有限公司; 第一链合成试剂盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA synthesis kit、PrimeScriptTM RT Master Mix购自TaKaRa公司。引物合成及常规测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2.1 长叶红砂幼苗培养及胁迫处理 挑选饱满长叶红砂种子, 10% NaClO浸泡10~15 min, 灭菌ddH₂O清洗3~5次, 播种于含有40 mL MS培养基的三角瓶中, 暗培养3 d后, 在25 ℃、相对湿度70%, 光周期为16 h光照/8 h黑暗条件下生长。待幼苗高约10 cm时, 转移至内含50 mL 1/2 Hoagland营养液的大试管中培养, 间隔3 d更换一次营养液。

在大试管中继续培养1个月, 选取长势一致的幼苗, 分别用30% PEG-6000、紫外照射(UV)、4 ℃及42 ℃、不同浓度 NaCl(200、400、600 mmol· L^-1)处理0、3、6、12和24 h, 采集叶片后经液氮速冻, 贮存于-80 ℃超低温冰箱中。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 长叶红砂总RNA的提取参照天根RNA Plant Plus植物总RNA提取试剂盒说明书进行。采用DNase I(RNase-free)消化RNA样本中的残余DNA, 分别用NanoVue Plus微量紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和完整性。

基因克隆所需的cDNA合成参照TaKaRa公司的PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA synthesis kit试剂盒说明书进行。PCR反应总体系20 μ L, 首先在PCR管依次加入1 μ L Random 6 mers, 1 μ L dNTP Mixture, 1 μ L长叶红砂RNA, 7 μ L RNase free dH₂O, 65 ℃反应5 min后冰上迅速冷却; 随后继续加入4 μ L 5× PrimeScript Ⅱ Buffer, 0.5 μ L RNase Inhibitor, 1 μ L PrimeScript Ⅱ RTase, 4.5 μ L RNase free ddH₂O, 缓慢摇匀, 30 ℃孵育10 min, 42 ℃反应 60 min, 95 ℃保温5 min; 最后冰浴冷却获得长叶红砂cDNA。

荧光定量PCR(Real Time quantitative PCR, qPCR)所需的cDNA合成参照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒说明书进行。反应体系为5× Mix 2 μ L, Total RNA 100 ng, 最后加入ddH₂O至10 μ L。反应程序为37 ℃下运行15 min, 之后85 ℃运行5 s, 在4 ℃下保存备用。

1.2.3 RtMYB1基因的克隆 根据长叶红砂高通量测序结果中功能注释为MYB转录因子(Unigene 21094)的Unigene序列设计引物(表1), 以长叶红砂cDNA为模板, 克隆获得Unigene 21094的ORF序列。PCR反应体系为25 μ L, 包含2.5 μ L 10× TransStart Taq buffer、0.2 mmol· L^-1 dNTPs、0.4 μ mol· L^-1上下引物、1 μ L TransStart Taq DNA Polymerase、1 μ L cDNA。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s、58 ℃复性30 s、72 ℃延伸 30 s, 30个循环, 最后72 ℃再延伸5 min。PCR产物经切胶回收, 转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 酶切鉴定后进行双向测序。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物名称Primer name 引物序列Primer sequence RtMYB1-S 5' ACTACCACAAACAGAAAGACAGGGAACG 3' RtMYB1-A 5' AATAAAACCCCTCCATCCACCTACTCTA 3' Actin-S 5' GAGGTCAAGCATTCACGACATCACG 3' Actin-A 5' CTGGCTGTTGTTATTAGGAGGAGGG 3'

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences

1.2.4 RtMYB1基因的生物信息学分析 利用NCBI的ORF Finder识别开放阅读框并翻译出氨基酸序列; 利用DNAMAN 6.0软件分析蛋白的理论分子量和等电点; 利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测蛋白二、三级结构; 蛋白序列比对用Clustal W软件执行; 系统进化树用MEGA 5.0软件, 邻接法(neighborjoining, N-J)绘制系统进化树。

1.2.5 RtMYB1基因的表达模式分析 以cDNA作为模板进行qPCR, 用β -Actin作为内参基因(表1)。参照Transgen公司的TransStartRTip Tip Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行。qPCR反应参照体系为20 μ L PCR, 内含2× TransStartRTip Tip Green qPCR SuperMix 10 μ L, 引物各0.4 μ L, cDNA模板1 μ L。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s、54~57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s, 35个循环, 72 ℃延伸10 min。

利用SPSS软件进行数据处理。

根据长叶红砂高通量测序结果中功能注释为MYB转录因子(Unigene 21094)的序列设计引物, 克隆获得了780 bp的ORF序列(图1), 编码236个氨基酸。该基因是第1个被发现的长叶红砂MYB基因, 因此命名为RtMYB1。

图1

Fig. 1

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	图1 PCR凝胶电泳图 M:DL2000 Maker; L1:PCR结果。Fig. 1 Product of PCR M: DL2000 Maker; L1: Product of PCR.

氨基酸序列分析显示, RtMYB1基因编码的蛋白具有典型的高度保守的DNA-结合结构域, 即MYB结构域, 属于MYB转录因子家族(图2)。RtMYB1蛋白相对分子量26.26 KDa, 等电点为8.75。氨基酸比对分析表明, 同源性最高的为大豆(Glycine max, ALA09221.1)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula, KEH44287.1), 同源性为94%; 其次为黄芩(Scutellaria baicalensis, AGZ16405.1), 同源性为83%; 最低的为拟南芥(Arabidopsis thaliana, AAC27179.1), 同源性为74%(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 RtMYB1的氨基酸序列比对Fig. 2 Comparison of the amino acid sequence of RtMYB1 GmMYB:大豆Glycine max(ALA09221.1); MtMYB:蒺藜苜蓿Medicago truncatula(KEH44287.1); SbMYB:黄芩Scutellaria baicalensis(AGZ16405.1); AtMYB:拟南芥Arabidopsis thaliana (AAC27179.1)。-:MYB 的DNA结合序列MYB DNA-binding sequence(10-53; 113-157)。

蛋白质二、三级结构预测显示, RtMYB1蛋白的236个氨基酸中, 50个是α 螺旋(蓝色), 占21.19%; 39个是延伸链(红色), 占16.53%; 21个是β 转角(绿色), 占8.9%; 126个是随机卷曲(紫色), 占53.39%(图3)。系统进化树分析显示, 长叶红砂RtMYB1转录因子与黄芩、蓖麻(Ricinus communis)、麻风树(Jatropha curcas)的亲缘关系较近, 与无刺枣(Ziziphus jujuba)、苹果(Malus domestica)的亲缘关系次之, 与绿豆(Vigna radiata)、野生大豆、木豆(Cajanus cajan)的亲缘关系较远(图4)。

图3

Fig. 3

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	图3 RtMYB1蛋白质的二、三级结构预测Fig. 3 The predicted secondary and tertiary structures of RtMYB1

图4

Fig. 4

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	图4 RtMYB1蛋白质系统进化树Fig. 4 The phylogenetic tree of RtMYB1

植物基因在受到不同的生物及非生物胁迫时会诱导发生不同的生理代谢功能以抵御胁迫, 所以基因的表达模式也不同。为了了解RtMYB1基因在不同非生物胁迫下的表达模式, 利用qPCR对RtMYB1基因在不同非生物胁迫下的表达情况进行了分析。结果显示, 该基因在不同梯度盐胁迫处理时, 相较对照均表现出表达量上升的趋势, 且在胁迫3 h时达到峰值(图5); 在其他胁迫条件下, 冷(4 ℃)和UV处理表达模式较为接近, 3 h处理时基因表达量最高, 然后下降, 在胁迫晚期(12-24 h)表达量又呈现出上升的情况; 高温(42 ℃)胁迫处理6 h后出现表达量的高峰; 而干旱胁迫(PEG)处理后, RtMYB1基因的表达量随胁迫时间的延长整体趋势呈现持续上升的状态(图6)。研究结果表明RtMYB1基因的表达受盐(NaCl)、冷(4 ℃)、高温(42 ℃)、UV和干旱(PEG)5种非生物胁迫的诱导, 且不同处理间RtMYB1基因的表达量存在差异, 因此推测, RtMYB1转录因子在长叶红砂响应非生物胁迫过程中可能起到了积极调控作用。

图5

Fig. 5

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	图5 RtMYB1基因在盐胁迫下的表达量变化Fig. 5 Changes in expression levels of RtMYB1 gene under salt-based abiotic stress

图6

Fig. 6

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	图6 RtMYB1基因在其他胁迫下的表达量变化Fig. 6 Changes in expression levels of RtMYB1 gene under other abiotic stress